桂郁金种质资源姜黄素类化学成分分析

靳雅惠

(西安外事学院，陕西 西安 710077)

桂郁金作为干燥块根入药，来源于姜科植物广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang，在活血止痛，行气解郁等方面功效显著，可治疗胸胁刺痛、胸痹心痛等症[1]。姜黄素类(姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素)作为郁金的主要化学成分[2]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用[3～5]。近年来，姜黄素类在化学成分[6～7]、提取工艺[8]、药理作用[9]等方面的研究越来越深入，但现有文献中未曾有以种质为研究对象，对桂郁金姜黄素类成分测定的报道，不利于桂郁金优良种质的筛选。遗传因子即“种质”，是药用植物质量优劣的根本内在机理，药用植物优良种质筛选是提高药材质量的有效途径，也是中药材生产质量管理规范的内在要求[10]，笔者立足于桂郁金种质，测定了50份材料姜黄素类成分含量，为桂郁金优良种质筛选及良种繁育工作奠定基础。

1 材料

1.1 植物材料

50份桂郁金种质前期均来自于广西玉林、邕宁、桂平等地，集中种植于邕宁药材基地，由广西中医药大学药学院王建教授鉴定均为姜科姜黄属植物桂郁金，即广西莪术块根Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang。60℃干燥后粉碎，过40目筛备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 Waters 2690高效液相色谱仪；电子天平；多功能粉碎机；超声波清洗仪；Agilent SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)

1.2.2 试剂 姜黄素对照品(批号：R25M6S1)；去甲氧基姜黄素对照品(批号：Y14JS9060)，双去甲氧基姜黄素对照品(批号：YM0506YA14)，三种对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%。乙腈色谱纯，冰醋酸、甲醇等为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器对三种姜黄素类成分分别进行扫描，姜黄素①、去甲氧基姜黄素②、双去甲氧基姜黄素③的最大吸收波长分别为426 nm、420 nm、415 nm，出于对各组分的检测信号强度和灵敏度的考虑，确定检测波长为420 nm。为表述方便简洁，后续使用代号①、②、③表示不同的姜黄素成分。

2.2 色谱条件

流动相：A相为乙腈，B相为0.25%的冰醋酸水溶液，梯度洗脱，见表1，检测波长420 nm,柱温30℃；流速1 mL·min-1,进样量10 μL。将混合对照品连续进样5次用以评价系统的适应性，姜黄素类各成分拖尾因子均小于1.2，分离度大于1.5，理论塔板数按各成分计均不少于3 000。HPLC色谱图见图1、图2。

表1 程序梯度洗脱表

图1 混合对照品溶液HPLC

图2 桂郁金样品HPLC

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液制备 精密称定各种质桂郁金粉末0.5 g，加入甲醇溶液30 mL，超声提取器提取60 mim(40 KHz，300 W)，挥干溶剂，用甲醇溶解后定容于2 mL量瓶，上清液过0.45 μm微孔滤膜，取10 μL进样，作为供试品溶液。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称定三种对照品适量，加入甲醇制成每1 mL分别含有①0.0781 mg、②0.0385 mg、③0.0366 mg的溶液，即得储备液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 不同质量浓度的对照品溶液由上述储备液稀释制成，按上述色谱条件，依次对不同浓度对照品溶液进行测定，进样量10 μL，横坐标代表对照品浓度，纵坐标代表峰面积，建立标准曲线。三种姜黄素类的回归方程、相关系数及线性范围分别是①：y=112 733x-50 920，R2=0.9995，线性范围为1.5792-16.4464 μg·mL-1；②：y=463 046x-190 699，R2=0.9999,线性范围为0.5264-11.3963 μg·mL-1；③：y=322 307x-205 776，R2=0.9998，线性范围为0.4353-6.3593 μg·mL-1。结果表明，三种姜黄素类成分的线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 精密称取同一混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪。按上述色谱条件连续进样6次，①、②、③的RSD值分别为0.52%、0.50%、0.88%，由此可见，该方法精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一种质桂郁金药材粉末6份，精密称定，制备供试品溶液并进行含量测定，结果显示，①、②、③的RSD分别为0.64%、0.55%、0.83%，由此可见，该方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一种质样品于不同时间段进样(0、2、4、6、8、12 h)测定峰面积，结果显示，①、②、③的RSD分别为1.02%、0.75%、0.92%，由此可见，供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 分别称取已知含量的桂郁金药材粉末，约0.25 g，共6份，精密称定加入等同于样品中的①、②、③含量的80%、100%、120%的对照品，参照上述方法进行供试品制备和HPLC分析，计算得出回收率。在回收率试验中，每个浓度设3次重复，计算得到平均回收率，如表2所示。由表可知，①、②、③的平均回收率分别为100.37%、100.66%、101.05%，RSD分别为2.49%、2.31%、2.71%，由此可见，加样回收率试验符合方法学要求。

表2 姜黄素类成分加样回收率试验结果

2.5 样品测定

按上述方法制备桂郁金各种质供试品溶液并进行3种姜黄素类成分的测定，每个种质平行3次，记录色谱图，用外标法计算3种姜黄素类成分的含量，如表3所示，50个不同种质桂郁金中，①、②、③的含量范围分别为1.658 0～15.293 0μg·g-1、0.535 9～8.120 6μg·g-1、0.501 1～5.191 7μg·g-1，总姜黄素的含量范围为1.963 5～26.839 8μg·g-1。50个桂郁金种质中，有32个种质检测到3种类型姜黄素，占到了所有种质的64%，表明3种类型姜黄素在大部分桂郁金种质中存在，且含量差异显著。7个种质检测到2种类型姜黄素，4个种质检测到1种类型姜黄素，7个种质未检测到任何类型姜黄素。

3 讨论

3.1 提取条件的考察

为了得到供试品最佳提取条件，依次考察了提取溶剂、提取方式和提取时间三个要素。在提取溶剂考察中，采用100%甲醇提取效率较高且峰形较好，50%甲醇和无水乙醇提取效率和峰形均较差，这可能是由于姜黄素类化合物水溶性差却极易溶解在甲醇中，故选择100%甲醇提取。在提取方式考察中，甲醇冷浸测定结果不理想，超声提取和加热回流结果相差不大，为了节约时间，故选择超声提取法。在提取时间考察中，取30 min、60 min、90 min三个梯度，结果显示60 min姜黄素类成分已基本提取完全，和90 min提取结果相差无异，故选择60 min作为提取时间。

3.2 流动相的选择

分别运用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.25%冰醋酸等流动相进行试验，结果表明，甲醇-水无法将3种姜黄素分开，乙腈-水形成的峰形较差，乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.25%冰醋酸均可得到分离度较好的峰形，这是由于酸性物质改善了拖尾现象，且0.25%冰醋酸效果更好，基线平稳，分析时间短，故选择乙腈-0.25%冰醋酸为流动相。

3.3 测定结果分析

笔者实验建立的HPLC方法能够同时测定桂郁金中3种姜黄素类成分的含量，共测定了50个不同种质，各种质所含姜黄素类成分类别及含量差异显著，表明不同种质药材质量优劣各异。笔者研究在7个种质中未检测到任何1种姜黄素类成分，可能是由于这7个种质本身质量不佳，含量较低，或者是采收加工中使用的方法不当，导致部分姜黄素类成分损失。在11个种质中检测到1种或2种姜黄素类成分，可能是由于这些种质本身其余成分含量较低，或者受姜黄素类成分见光易分解的影响，分解为同一类物质。

表3 50份不同种质桂郁金姜黄素类成分含量