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超声波辅助黄芩总黄酮提取及抗氧化性能研究

时间:2024-05-30

辛莹娟,李 祯

(咸阳职业技术学院,陕西 咸阳 712000)

黄芩是中医治疗皮肤病的常用药材,同时黄芩具有清热、解毒、凉血、安胎等功效而被广泛应用[1~3]。目前,研究人员已从中药黄芩中发现了包括黄酮类、皂苷类等2 000余种有效物质,但其中应用最广泛的为黄酮类化合物,具有抗氧化、抗变态反应、抑菌、抗病毒、镇静等功能,可治疗哮喘等呼吸道感染、过敏性疾病、妇科疾病及皮肤科疾病(如:痤疮、酒糟鼻、银屑病、日晒性皮炎、黑斑等)[3~11]。

对比浸提、煎煮和回流等传统中药黄酮类化合物提取方法,超声能在低频作用下使草本药物细胞瞬间空化、破裂,促使药物有效成分与提取溶剂充分接触并增大其在溶剂中的溶解度,获得高提取率[12]。笔者研究拟通过超声辅助提取技术以降低溶剂消耗,明确相关提取技术的最佳工艺参数。并且,进一步考察黄芩总黄酮的DPPH抗氧化性能,为黄芩黄酮产品开发奠定基础。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

1.1.1 实验试剂 黄芩(陕西省咸阳市药材市场),无水乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、氢氧化钠(AR,重庆茂业化学试剂有限公司),芦丁标准品(HPLC 98%,国家标准物质中心),1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,AR,Sigma-Aldrich公司)。

1.1.2 实验仪器 MS180磁力搅拌器,L9双光束紫外可见分光光度计,XSD-300超声波清洗机,ZFY-2L旋转蒸发仪,PHG9246电热鼓风干燥箱,HX-200粉碎机,BP211D电子天平。

1.2 实验步骤及表征

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 于容量瓶中分别加入不同体积浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁标准品、5% NaNO2、10% Al(NO3)3、1.0 mol·L-1NaOH溶液,乙醇定容,摇匀。根据吸光度与浓度的线性关系得图1标准曲线,方程为:A = 0.01666+9.40571C,R = 0.99998。

图1 芦丁标准曲线

1.2.3 黄芩总黄酮提取工艺 主要有:

(1)乙醇浓度对黄酮收率的影响。100 mL三角瓶中称1 g黄芩细粉,按1∶20料液比分别加入(40%、50%、60%、70%、80%和90%)的乙醇液,40 ℃、54 kHZ、350 W超声30 min,再于60 ℃回流1.0 h,抽滤后为滤液a,再对残渣重复提取两次后得滤液b和c,合并滤液,测定吸光度。

(2)料液比对黄酮收率的影响。同上述操作,以料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入60%乙醇液,40 ℃、54 kHZ、350 W超声30 min,再于60 ℃回流1.0 h,抽滤后为滤液a,再对残渣重复提取两次后得滤液b和c,合并滤液,测定吸光度。

(3)提取温度对黄酮收率的影响。同上述操作,以1∶40料液比加入60%的乙醇液,40 ℃、54 kHZ、350 W超声30 min,分别于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃回流1.0 h,抽滤后为滤液a,重复提取两次后得滤液b和c,合并滤液,测定吸光度。

(4)提取时间对黄酮收率的影响。同上述操作,按1∶40加入60%乙醇液,40 ℃、54 kHZ、350 W超声30 min,70 ℃分别回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h,抽滤后为滤液a,重复提取两次后得滤液b和c,合并滤液,测定吸光度。

(5)超声时间对黄酮收率的影响。同上述操作,按1∶40加入60%乙醇液,40 ℃、54 kHZ、350 W超声10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,再于70 ℃回流1.5 h,抽滤后为滤液a,重复提取两次后得滤液b和c,合并滤液,测定吸光度。

1.2.4 抗氧化研究 DPPH法是基于DPPH自由基的孤独电子与抗氧化剂配对使517 nm处DPPH的光吸收减弱或消失,线性对比获得抗氧化剂的自由基清除率。因此,测定系列不同浓度的黄芩总黄酮试样的自由基清除率,获得关系图谱。DPPH清除率按下式计算:

式中,A0:DPPH和无水乙醇;A1:DPPH和黄芩总黄酮溶液;A2:黄芩总黄酮溶液和无水乙醇。

2 实验结果与分析

2.1 乙醇浓度对黄酮收率的影响

黄芩黄酮提取率随乙醇浓度变化趋势如图2所示,60%乙醇浓度为极值点。当小于60%乙醇浓度时,黄酮有效溶出率随乙醇含量提高而逐步增加,大于60%乙醇浓度时,由于乙醇含量越高,溶质黄酮类物质和干扰成分醇溶性杂质和脂溶性成分之间竞争性增强,黄酮提取率降低。

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.2 料液比对黄酮收率的影响

料液比偏低时,虽然黄芩细粉可与溶剂充分接触,但黄芩含量过低,有效成分含量过低。当料液比偏高时,增大了黄芩比率,料液有效接触的同时提高了黄酮、可溶性蛋白、醇溶性和脂类物质等的溶出量,反而会导致黄酮组分分离损失增大,所以从图3可知,1∶40为最佳料液比。

2.3 提取温度对黄酮收率的影响

黄芩总黄酮提取率随提取温度的变化规律如图4所示,提取温度为70 ℃对应7.94%的最大提取率。逐步升高提取温度可提高黄酮等药效物质分子的运动速率,黄酮类物质扩散速度加快,能够获得高的黄酮提取率。但温度过高,除了黄酮类化合物扩散加快,醇溶性杂质、多糖和脂溶性杂质扩散速度也随之加快,两者相互影响反而降低黄酮类化合物提取率。同时高温提取过程中还伴随着黄酮类化合物的氧化反应,故而提取率先增大后减小。

图4 提取温度对黄酮提取率的影响

2.4 提取时间对黄酮收率的影响

干燥的黄芩细粉被乙醇溶液充分浸润并溶解出黄酮类有效成分需一定的时间,因此,逐渐提高黄芩细粉与乙醇接触时间,将获得越来越高的黄酮提取量,当提取1.5 h时,提取率最大(从图5可知)。但是,高温下黄芩细粉与溶剂乙醇接触时间过长,会导致黄酮在高温下逐步发生氧化、分解等反应而发生变质,且脂溶性杂质、醇溶性杂质等的溶解析出会影响黄酮溶出率,反而使提取率下降。

图5 提取时间对黄酮提取率的影响

2.5 超声时间对黄酮收率的影响

超声是利用高频声波所产生的机械、空化和热效应等综合效应,击破中药材细胞壁,提高目标物黄酮类化合物的穿透力和扩散能力。因此,从图6可知,超声时间越长,高频声波作用于黄芩细粉的综合能量越高,提取率越大。但当增长超声时间超过40 min对应的8.53%最高黄酮提取率时,提取率变化极小。

图6 超声时间对黄酮提取率的影响

2.6 黄芩总黄酮抗氧化性能的影响

黄酮类化合物可有效清除人体中性质活泼的自由基,降低由于自由基存在所导致的蛋白质变性、细胞功能破坏等问题,并提高人体细胞抗氧化的能力,改善自由基强氧化性所造成的心血管、衰老等疾病。从图7可知,黄酮浓度越大自由基清除率越大,100 mg·mL-1时最大为65.33%。

图7 黄酮的自由基清除率

3 结论

黄芩在中药化妆品中广泛应用,其中作为黄芩主要药效物质的黄酮类化合物研究和应用最多。采用超声辅助技术和传统的乙醇回流技术相结合提取黄芩中的总黄酮,考察了两种提取技术相结合应用中的多个提取工艺参数,对比分析获得60%乙醇浓度、1∶40料液比、70 ℃提取温度、1.5 h提取时间和40 min超声辅助为最佳提取工艺,且此时黄芩中黄酮提取率最高为8.53%。同时,利用黄酮浓度与DPPH自由基清除率之间的关系图直观获得了黄芩黄酮清除自由基的抗氧化性能,结果表明随着浓度增加,黄酮抗自由基活性逐步提高。

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