施氮对小麦生长、生理及叶绿素荧光响应的影响

王佳璇，屈魏蕾，田玉磊，张蓓蓓

(陕西省灾害监测与机理模拟重点实验室/宝鸡文理学院 地理与环境学院，陕西 宝鸡 721013)

作为我国三大粮食作物之一的小麦在全国广泛种植，目前我国种植的冬小麦产量已经占到全国粮食作物的20%[1]。小麦属于禾本科植物，它本身没有固氮能力，需要从土壤中吸收氮素来维持生长发育，但天然土壤中的氮素含量不足以满足作物生长需求，影响作物产量[2]。因此适当施加氮肥可以增加禾本科作物产量[3]。氮肥施用对与小麦生长生理的影响一直备受国内外学者关注。赵新春[4]研究了半干旱黄土区氮肥不同用量对小麦生长和产量的影响，并得出结论小麦最佳施氮量在80 kg·hm-2。据统计陕西关中地区冬小麦、夏玉米的施氮量大约在150～250 kg·hm-2，为了达到更高的作物产量，陕西关中局部地区依旧存在着过量使用氮肥的现象，这样不仅会降低作物产量还会对土壤质地造成破坏[5～6]。已经有众多研究结果表明，小麦生长状况及其产量与施氮量呈现抛物线关系，呼红伟[7]等对关中干旱区施氮用量研究显示当施氮量超过150 kg·hm-2时产量会下降，而在此之前，小麦的产量随着施氮量的增加呈现上升趋势。因此合理利用氮肥不仅可以增加作物产量还可以保护土地资源。

光合作用是地球上植物生长以及其他生物生存的基础条件，当植物吸收光能后叶绿素分子会跃迁到高能态，然后利用三种相互竞争的方式回到基态：①释放电子产生荧光。②直接以热的形式耗散掉。③将能量传递到另一个叶绿素分子中，进行光化学反应[8]。对植物叶绿素荧光的测定技术可以在不伤害植物叶片为前提的基础上对植物光能的分配进行分析，因此也被称作测定植物光合作用快速无伤探针，其参数包含丰富的生理信息，为小麦光合生理研究提供了技术手段[9]。植物在经过暗适应后暴露在光照下荧光值会随时间变化而变化，这一变化的曲线就是叶绿素荧光诱导曲线(OJIP曲线[10]。该曲线可以反应出植物光化学反应中心的初始光反应速率以及植物光化学反应状态。诸多学者对受不同比重施氮下的小麦生长、生理变化进行了研究[4, 11～12]，但鲜有不同施氮水平对小麦叶绿素荧光特征变化的研究。笔者研究采用叶绿素荧光分析技术，对“九麦2号”品种小麦施加五种不同浓度的氮肥，从不同氮肥施用量对小麦生长、生理指标的影响着手，分析得出小麦最佳的生长状况，以期对小麦施氮增产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用“九麦2号”小麦品种，该品种为半春性，中熟。幼苗稍匍匐，叶色深绿，叶片宽短，旗叶上挺，茎秆坚硬，株型紧凑，高抗倒伏。穗呈长方形，穗大、均匀、多花多粒，结实性好。白壳、短芒，籽粒白色。

1.2 研究区概况与试验设计

试验于2018年在宝鸡文理学院地理与环境学院实验室(107°12′E，34°21′N，海拔580 m)内进行。供试土壤质地为粉砂质粘壤土，基础含氮量为0.779 g·kg-1，于直径25 cm、高20 cm的花盆种植小麦，每盆播种小麦种子10颗。所有盆栽于2018年10月26日放置在FYTOSCOPE人工培养箱中，设置昼夜温度为25℃/15℃，光照周期为16 h/8 h，土壤湿度保持在75%(v/v)条件下进行培养。试验共设置5组处理组(表1)，每组处理有3个重复。

表1 试验处理及施氮浓度

1.3 测定方法

1.3.1 小麦叶片生长生理参数测定 比叶面积(SLA)：每组每盆选取三张拔节期旗叶叶片，测量叶片长度和最宽处宽度，先利用叶面积计算公式：0.76×叶长(cm)×叶宽(cm)计算叶面积[13]，将测量后的叶片于烘箱中烘干48 h，称量叶片恒重，计算比叶面积：SLA=叶面积(cm2)/叶重(g)。

用考马斯亮蓝(CBB)法测定植物叶片可溶性蛋白(SP)[14]。用蒽酮法测定可溶性糖(SC)(Jermyn，1975)[15]。用露点水势仪(WP4，Decagon Devices，Pullman，美国)测定叶片水势(WP)[16〗。用硫代巴比妥酸法测定叶片丙二醛(MDA)(Draper et al.,1993)[17]。用Litchtenthaler(1983)在645，663 nm处测定叶片Chla和Chlb浓度(Litchtenthaler and Wellburn, 1983)

1.3.2 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和参数的测定 小麦拔节期期间在不同试验各组随机选取一片叶片，进行20 min暗适应后，使用FluorPen FP 100Max手持荧光仪(Photon Systems Instruments，Brno，Czech Republic)对叶片进行荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线的测定。荧光参数如表2所示[18]。

表2 叶绿素荧光基本参数和衍生参数分析

为了比较OJIP曲线及其之间的归一化PF瞬态曲线，使用以下公式：

Vt=(Ft-Fo)/(Fp-Fo)

(1)

ΔVt=VtTR-VtCK

(2)

1.4 数据处理

利用Excel 2016进行数据整理；SPSS 25.0进行one way-ANOVA分析；用LSD法进行参数间差异显著性检验和多重比较；采用Origin8.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同梯度施氮量对小麦生长指标的影响

从表3可以看出，不同处理下的小麦叶重(LW)、叶长(LL)、比叶面积(SLA)等生长性状均存在显著性差异(F=220.625、225.719、59.515,P<0.01)。随着施肥量的增加，小麦叶片生理特性整体呈先上升后下降的趋势，在N135处理下生长指标达到最大值。并且在N135处理下，叶重、叶长和比叶面积分别高于N0处理81.1%、40.1%和67.4%。

表3 不同梯度施氮量对小麦叶重、叶长、比叶面积的影响

2.2 不同梯度施氮量对小麦生理指标影响

由图1可以看出：随着施氮量的增加，可溶性蛋白(SP)和可溶性糖(SC)的变化趋势均为先增加后降低。在N90处理下的SP值为最高，显著高于N0、N180处理下的结果，分别比N0、N180高出20.62%和7.60%。而N135处理下的SC值为最高，显著高于N0、N45，分别比N0和N45高出了72.42%和39.57%。

图1 不同梯度施氮量对小麦可溶性糖、可溶性蛋白含量的影响

从表4可以看出：丙二醛(MDA)的含量随着施氮量的增加呈现先降低后升高的趋势，在不同梯度氮处理下的小麦MDA含量存在显著差异，其中以N135处理含量最低，分别比N0、N45、N90和N180处理低143.22%、23.08%、12.97%和35.31%(P<0.01)；水势随着施氮量的增加呈现升高趋势，在N180处理下，水势最接近0，分别比N0、N45、N90和N135处理高出38.67%、36.89%、32.48%和29.57%(p<0.01)。叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总含量的趋势均为随着施氮量的升高呈现出先升高后下降的趋势。在N135处理下的叶片叶绿素a、叶绿素和总叶绿素含量均为最高。N135处理下叶绿素a含量分别较N0、N45、N90和N180高出87.90%、26.13%、9.60%和78.62%。N135处理下叶绿素b含量较N0、N45、N90和N180高出103.88%、27.72%、6.93%和94.40%。N135处理下叶绿素总含量较N0、N45、N90和N-180高出90.83%、26.44%、9.07%和81.51%。不同施氮水平下丙二醛、水势、叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量值均存在显著差异，其中以MDA的差异最大(F=367.38，P<0.01)。

表4 不同梯度施氮量对小麦各生理指标的影响

2.3 不同梯度施氮量对小麦叶绿素荧光参数的差异分析

由表5可知，初始荧光(Fo)值变化趋势为整体上升，在N180处理时为最高，相比N0处理高出6.32%，最大荧光(Fm)值在N45处理下达到最大，在施氮处理下Fm值显著增加。Mo值与PIABS值均呈现出先上升后下降的趋势，并且均在N135处理下达到最大值，分别较最低值N0处理下高出30.88%和79.89%。相较于Fm值存在显著性差异，Fo、Mo、PIABS值均存在极显著性差异(F=10.29、12.64、6.24，P<0.01)。

表5 不同梯度施氮量对小麦叶绿素荧光参数的差异分析结果

在5种不同的处理下，N135处理对反应中心比活度(RC)影响最大且均达到了最大值， ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC值存在显著性差异(F=69.13、29.34、16.96，P<0.01)，ETo/RC值没有显著差异(F=0.32，P>0.05)。

2.4 不同梯度施氮量对小麦叶绿素荧光诱导曲线的差异分析

叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)可以反映出PSⅡ反应中心光化学反应的信息[19]。O相是叶片暗适应后初始荧光的积累值，J相的荧光强度升高是由于QB没有及时接收、还原来自QA-的电子使得QA-的电子累积所致，I相和P相是由于快还原型PQ库和慢还原型PQ库被完全还原后形成[20]。通过对OJIP瞬态曲线的测量，由图2(A)可知，不同处理下的小麦叶片OJIP曲线变化趋势基本相同，不同处理下O点差异不显著，但各时间点和形态有所差异，O点到P点处N135处理下的荧光强度最强，其余处理按强度从大到小依次是N90、N45、N180、N0。从J点开始，不同施氮处理下的小麦叶片荧光值开始出现差异，N135处理下最高，分别高出N0、N45、N90、N180处理25.82%、8.14%、5.02%、12.23%。在I点差异逐渐增大，其中N135处理分别高于N0、N45、N90、N180处理28.98%、6.87%、6.74%、14.23%。P点处，荧光值趋于稳定，且最大荧光值表现为N135>N45>N90>N180>N0。在图2(B)中，相对可变荧光(Vt)在I点(30 ms)处的差异最大，不同处理下的可变荧光差异随着时间的推移呈现出先增大后减小的趋势，且N135处理显著高于其他处理下的ΔVt。

图2 不同梯度施氮处理的小麦叶片叶绿素荧光诱导动力曲线

2.5 不同梯度施氮处理对小麦叶片光响应曲线(LC)的差异分析

在五种不同处理下，N90处理下的叶片量子产额(QY)在10μmol·m-2·s-1)PPFD出现最大值说明光补偿点(LCP)在10μmol·m-2·s-1PPFD左右。其余处理下的最大值均在10μmol·m-2·s-1PPFD之前，说明其LCP均早于10μmol·m-2·s-1PPFD。

图3 量子产率(QY)在五种不同处理下的光响应曲线

2.6 不同梯度施氮量处理下小麦生长、生理特性、叶绿素含量、荧光参数相关性分析

对不同处理下的小麦叶片生长生理指标、叶绿素含量及荧光参数进行相关性分析，由表6可知，叶绿素荧光参数ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC、PIABS与小麦叶片的生长特性LW、LL、SLA以及生理特性SP、SC、WP、Chla、Chlb、Chla+b呈现正相关，与生理特性MDA、Chla/b呈现负相关。其中SLA与ETo/RC、PIABS呈现极显著正相关，与ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC呈显著正相关；SC与TRo/RC、ETo/RC、PIABS呈现显著正相关。叶片MDA与ETo/RC呈极显著负相关，与PIABS呈显著负相关。

表6 小麦叶片生长、生理、叶绿素含量及其荧光参数相关性分析

3 结论与讨论

小麦作物高产的前提是具有较高的干物质和较大的养分积累[21]，研究表明氮肥作为提高作物产量的关键因素，合理施加氮肥可以有效促进小麦干物质量和氮素的积累[22～23]，小麦植株氮素累积变化符合Logistic曲线，施氮能够促进小麦干物质以及氮素的累积，变化趋势呈现出先增加后降低的趋势[24]，赵风华[25]等的研究表明过量施氮会使小麦生长受损。在笔者试验中，添加氮肥处理下小麦叶片生长指标均显著高于未施氮处理，说明施氮处理有助于小麦生长，这与李华伟[26]等的研究结果相似，在N135时达到最大值，N180处理下生长指标有下降趋势，表明施氮量在135 kg·hm-2时小麦SLA、LW和LL长势较好，过高氮肥施加不利于小麦的生长。

可溶性糖(SP)与可溶性蛋白(SC)是成熟小麦中的重要组成部分，两者含量的高低决定着小麦的品质优劣。董伟欣[27]等研究了在不同的水肥处理下小麦叶片SC的变化趋势，SC的变化差异显著，施氮处理较不施氮处理显著提高，结果说明了高氮多水有利于SC的积累。氮素同样对植物叶绿素合成起关键作用，进而影响植物光合作用，如在相同条件下，增加氮肥施用量后，小麦叶片的蒸腾速率、净光合速率以及气孔导度均呈上升趋势，小麦叶绿素和可溶性蛋白都有所增加[28～29]。笔者试验中小麦生理特性SP、SC、WP、Chla、Chlb、Chla+b在施氮处理下较不施氮处理有显著提高，但在N180处理下，生理指标值开始出现下降说明适度的施氮有利于提高小麦生理指标，135 kg·hm-2施氮量下可以达到较高的生理指标。Chla/b在五个不同处理下无显著性差异，说明施氮水平的高低对小麦捕光能力影响较小。丙二醛(MDA)的含量可以反映植物受胁迫程度，它的产生可以加剧植物细胞和不同组织膜的损伤，当植物衰老时其体内MDA含量便会上升，合理的施用氮、磷肥可降低植株体内MDA值[30]。笔者试验对拔节期小麦MDA含量的方差分析表明氮肥对小麦体内MDA的影响达到了极显著水平(P<0.01)，施氮处理下小DA含量低于不施氮处理，这是由于氮是酶的重要组成成分，以酶的形式参与植物的各种代谢过程促进生长素和细胞分裂素的合成，延缓衰老进而使丙二醛含量降低。在N135处理下MDA含量达到最低后在N180处理下出现回升，说明合理的施用氮肥可以降低小麦MDA含量，过量的施肥反而不利于小麦体内MDA含量的减少。

Fo(初始荧光)数值越低代表植物对光能的利用率越高[31]。笔者试验中随着施氮量的增加，Fo的值持续增大，N180处理下的初始荧光值最大，说明在N180处理下小麦叶片光能利用达到最低。Fm(最大荧光)数值越低代表电子反应程度越小[32]。试验中最大荧光值随施氮量的增加呈现出先升高后降低再升高再降低的趋势，Fm值在N45处理下达到最大，且显著高于N0、N180处理(P<0.05)，与N90、N135处理差异不显著，说明在N45、N90和N135三个处理下电子较为活跃。Mo主要反映PSⅡ受体侧变化，PSⅡ受体侧主要包括QA、QB、PQ库等[33]。笔者试验中N135处理下Mo值最高，说明QA传递电子的能力小，多用于自身还原，与其他四个处理差异显著(P<0.01)。光化学性能指数(PIABS)与Mo变化趋势一致，以N135处理下的最大，说明光合性能最强。ABS/RC的增加表明适量施氮使活跃PSⅡ反应中心的数量增加，增强了叶片暗积累。TRo/RC的增加表明施氮RC捕获电子的速率增大，更多QA转化为QA-，使得其与传递电子的能量(ETo/RC)一同随之增大。

快速叶绿素荧光动力学曲线就是荧光从O点到P点的变化过程，它的变化与植物生长生理息息相关。笔者试验中小麦叶片的OJIP荧光曲线都受到了施氮的影响，O-J(0.05～5ms)段表现出较大值，代表QA-大量积累，PSⅡ活性中心的数量减少。随着时间的推迟，J-I(5～50 ms)段和I-P(50～1 000)段荧光值依旧较大，代表PQ的相对数量减少，流向PSⅠ末端电子受体的动力学速率增大。

综上所述，N135梯度处理下可以显著改善“九麦2号”的生长指标，促进小麦高质量生长发育，最终增加小麦产量。其次对小麦的可溶性蛋白、叶绿素含量等生理指标也有显著的提升，丙二醛随之降低。并且对叶绿素荧光以及PSⅡ光化学活性有一定的提升。建议在田间土壤施肥中将施氮量控制在135 kg·hm-2左右。