绵羊BMP2、BMP4 和BMP7 基因多态性与产羔数的关联分析

时间：2024-05-30

孟科，荣轩，梁鹏，强浩，冯登侦

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

我国养殖的大多数绵羊都为单羔品种，生产时出现双羔以及多羔的情况比较少，筛选绵羊的多胎基因可以显著提高其繁殖力，有利于提高养殖户的经济效益。绵羊多羔性状是绵羊育种和生产中的一个重要繁殖性状，受到遗传、饲养环境、激素、营养等多因素的综合影响。随着现代分子生物学技术的发展，绵羊多羔性状的候选基因已被众多学者进行了深入研究，大多集中在转化生长因子（Transforming Growth Factor-，-）超家族和骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，）通路或与之相关的信号通路。

骨形态发生蛋白（）属于-超家族的一员，该蛋白大约有20 多个家族成员，其成员在结构上相似，但其功能在不同时期和不同阶段有着很大的区别。与哺乳动物的多种功能密切相关，该蛋白不仅可诱导软骨和骨的形成，而且对于调节动物繁殖、细胞分化和细胞凋亡具有非常重要的作用。、和基因是骨形态发生蛋白家族的重要成员。据研究表明，在体外培养的牛卵泡中，10 ng/mL的可促进原始卵泡的发育并维持次级卵泡的超微结构，100 ng/mL 的可促进原始卵泡、次级卵泡和卵母细胞的直径增加。Kumar 等研究发现，在水牛妊娠的不同阶段，基因mRNA 和的表达量在妊娠早期均显著上升，基因mRNA 表达量在妊娠晚期也明显上升。Tanwar 等研究发现，基因及其下游靶蛋白（pSMAD1/5/8）在小鼠卵泡发育的各个阶段均有表达。还有研究结果表明，小鼠敲除基因后，将导致子宫缺陷甚至生育能力降低。这些研究均说明、和基因在动物繁殖方面起着关键作用。

本实验以杜泊羊、滩寒杂交羊、杂一代、杂二代和横交一代5 个绵羊群体为研究对象，基于Ensemble 数据库中查到的、和基因的错义突变位点（g.48462350C＞T、g.63454744T＞G、g.58171856C＞G），利用Sequenom MassARRAYSNP 技术对3 个突变位点进行基因型检测，探究不同绵羊群体、和基因SNP 位点的多态性，并与产羔数进行关联分析，筛选影响5 个绵羊群体多羔性状的关键位点，为上述绵羊群体产羔数的选育提供分子标记。

1 材料与方法

1.1 实验材料本研究的实验个体均来自宁夏宇泊科技有限公司石嘴山威震肉羊繁育场，各羊群信息如表1 所示。实验羊均为健康无病、饲养管理一致的成年母羊。将采集的耳组织放入75%酒精，-20℃保存备用。

表1 实验羊群信息

1.2 基因组DNA 提取绵羊耳组织样本使用组织DNA磁珠法提取试剂盒对DNA 进行提取，-20℃保存，用于后续的飞行质谱基因型检测。

1.3 飞行质谱检测采用Sequenom MassARRAYSNP 技术对768 只绵羊的、和基因3 个位点（rs号分别为rs160577278、rs416697440 和rs422626052）在5 个绵羊群体进行基因型检测，待检样品为DNA。该步骤交由北京康普森农业科技有限公司完成，具体实验步骤如下。①引物设计：根据Ensemble 数据库中公布的绵羊、和基因SNP 位点信息，使用Sequenom 公司的引物设计软件Assay Design 3.1设计待测SNP 位点的PCR 反应和单碱基延伸引物（表2）；②DNA 质检；③PCR 扩增：该步骤在384 孔板中进行，PCR 反应体系：0.5 μL 的10×PCR Buffer，0.4 μL 的MgCl（（25 mmol/L），0.1 μL 的dNTP Mix（25 mmol/L），1 μL 的Primer Mix（0.5 μmol/L），0.2 μL 的HotStar Taq（5 U/μL），1.8 μL 的去离子水，1 μL 的10 ng/μL DNA，总反应体系为5 μL/ 孔。PCR反应程序：94 ℃预变性120 s，94 ℃变性20 s、56 ℃复性30 s、72 ℃延伸60 s（45 个循环），72 ℃延伸180 s，4 ℃保存；④虾碱性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）消化；⑤单碱基延伸；⑥树脂纯化；⑦芯片点样；⑧质谱检测。

表2 SNPs 位点引物信息表

1.3.8 数据处理采用Microsoft Excel 2019 软件统计绵羊、和基因3 个位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），进行哈代 -温伯格平衡检验。用SPSS 22.0 软件程序中一般线性模型对5 个绵羊群体各基因型与产羔数表型数据的关联分析，数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取质检结果利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测5 个绵羊群体耳组织DNA 的纯度、浓度和完整性。DNA 提取质检结果显示，单个样品浓度都在50 ng/μL以上，OD/OD为1.7～2.1，无大分子污染；电泳条带均单一、清晰（图1）。

图1 DNA 电泳图

2.2、和基因分型结果由图2 可知，基因的g.48462350C＞T 位点存在CC、CT、TT 3 种基因型。结果表明，该位点的CT 基因型个体数最多，TT 基因型个体数较少。基因的g.63454744T＞G位点存在GG、GT、TT 3 种基因型。结果表明，该位点的TT 基因型个体数最多，GG 基因型个体数较少。基因的g.58171856C＞G 位点存在CC、GC、GG 3 种基因型。结果表明，该位点的CC 基因型个体数最多，GG 基因型个体数较少。

图2 BMP2、BMP4 和BMP7 基因3 个位点的分型结果

2.3基因多态性分析及其与绵羊群体产羔数的关联分析

2.3.1基因SNP 位点的群体遗传学分析基因的g.48462350C＞T 位点在5 个绵羊群体中均存在CC、TC、TT 3 种基因型；经卡方适合性检验分析，该位点在D 群体不处于哈代-温伯格平衡状态（＜0.05），在其他群体均处于哈代-温伯格平衡状态（＞0.05）（表3）。该位点在5 个群体中均处于中度多态（0.25＜PIC＜0.5）（表4）。

表3 BMP2 基因频率和基因型频率

表4 BMP2 基因SNP 位点群体遗传学分析

2.3.2基因与绵羊群体产羔数的关联性分析对结果样品进行校正，对群体数量低于5% 的基因型淘汰后再对其他基因型进行分析，然后对基因g.48462350C＞T 位点的不同基因型与5 个群体的产羔数进行关联分析。结果表明：该位点不同基因型与5 个绵羊群体的产羔数均无显著差异，不适用于上述绵羊群体多羔性状的选育（表5）。

表5 BMP2 基因在5 个绵羊群体中基因型与产羔数的关联分析

2.4基因多态性分析及其与绵羊群体产羔数的关联分析

2.4.1基因SNP 位点的群体遗传学分析基因的g.63454744T＞G 位点在D、H群体中存在GT、TT 2 种基因型，在其他群体均存在GG、GT、TT 3 种基因型，该位点在5 个绵羊群体的优势基因型为TT，优势等位基因为T；经卡方适合性检验分析，该位点在5 个群体均处于哈代-温伯格平衡状态（＞0.05）（表6）。该位点在5 个群体中均表现为低度多态（PIC＜0.25）（表7）。

表6 BMP4 基因频率和基因型频率

表7 BMP4 基因SNP 位点的群体遗传学分析

2.4.2基因与绵羊群体产羔数的关联性分析对结果样品进行校正，对群体数量低于5% 的基因型淘汰后再对其他基因型进行分析，然后对基因g.63454744T＞G 位点的不同基因型与5 个群体的产羔数进行关联分析。结果表明：该位点不同基因型与5 个绵羊群体的产羔数均无显著差异（＞0.05），不适用于上述绵羊群体多羔性状的选育（表8）。

表8 BMP4 基因在5 个绵羊群体中基因型与产羔数的关联分析

2.5基因多态性分析及其与绵羊群体产羔数的关联分析

2.5.1基因SNP 位点的群体遗传学分析基因的g.58171856C＞G 位点在D、TH 群体中存在CC、GC 2 种基因型，在其他群体均存在GG、GC、CC 3 种基因型，该位点在5 个绵羊群体的优势基因型为CC，优势等位基因为C；经卡方适合性检验分析，该位点在5 个群体均处于哈代-温伯格平衡状态（＞0.05）（表9）。该位点在5 个群体中均表现为低度多态（PIC＜0.25）（表10）。

表9 BMP7 基因频率和基因型频率

表10 BMP7 基因SNP 位点的群体遗传学分析

2.5.2基因与5 个绵羊群体产羔数关联性分析对结果样品进行校正，对群体数量低于5% 的基因型淘汰后再对其他基因型进行分析，然后对基因g.58171856C＞G 位点的不同基因型与5 个群体的产羔数进行关联分析。结果表明：该位点不同基因型均与5个绵羊群体的产羔数无显著差异，不适用于上述绵羊群体多羔性状的选育（表11）。

表11 BMP7 基因5 个绵羊群体中基因型与产羔数的关联分析

3 讨论

3.1基因与产羔性能的关系 Otsuka研究发现，骨形态发生蛋白中主要是以、和基因通过调节颗粒细胞的增殖和类固醇的生成，在雌性动物生殖过程中发挥着关键作用。Χie 等通过荧光定量PCR 发现，和基因在新西兰兔的卵巢发育过程中均有表达，其中60 日龄的卵巢中和的表达量均显著高于120 日龄和6 日龄，且基因的表达量始终高于基因的表达量。还有研究发现，基因可诱导人颗粒细胞中卵泡刺激素受体（FSHR）的表达，同时还降低促黄体生成素受体（LHR）和类固醇生成的急性调节蛋白（STAR）的表达，从而促进卵泡的生成。魏强研究发现，基因位点的不同基因型与猪的总产仔数、活产仔数、断奶头数上差异极显著。除此之外，张壮彪等发现基因在绵羊性腺轴的7 种组织中均有表达,其中产多羔的小尾寒羊输卵管、卵巢、下丘脑、垂体、小脑的表达量均高于产单羔苏尼特羊。Zhang 等在后续研究中发现，基因的g.48462350C＞T 位点与小尾寒羊平均产羔数显著相关（＜0.05），这与本实验的研究结果不一致，可能是因为选择的群体不同所导致的。因此，基因可能通过调控卵巢发育和卵巢功能对雌性动物的产羔性能产生影响。

本研究发现，基因的g.48462350C＞T 位点在杜泊羊、滩寒杂交羊、杂一代、杂二代、横交一代5个绵羊群体中均表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），表明该位点在上述群体中存在较强的选择和育种潜力。卡方适合性检验分析表明，该位点在D 群体不处于哈代-温伯格平衡状态（＜0.05），这可能与本实验的人工选择有关，在其他群体均处于哈代-温伯格平衡状态（＞0.05），表明该位点在其他群体具有适应性较强的优势。进一步与产羔数关联分析发现，该位点不同基因型之间均与产羔数无显著差异（＞0.05），即该位点不适用于上述5 个绵羊群体多羔性状的选育。

3.2基因与产羔性能的关系徐业芬等研究发现，基因mRNA 在湖羊多羔组中的表达量极显著高于单羔组，其在后续研究中发现，基因mRNA 的表达量在高繁殖率的湖羊组中显著高于低繁殖率的湖羊组。同时，韦涛的研究结果表明，湖羊卵巢组织基因mRNA 的表达水平与排卵数呈极显著正相关，该基因A298C 位点AA 型个体第三胎产羔数和经产平均产羔数均显著高于AB 型，表明基因在湖羊卵泡发育过程中发挥着重要作用。此外，孙振梅研究发现，在单多羔两组黔北麻羊的垂体、输卵管、子宫、下丘脑、卵巢5 个繁殖组织中均检测到基因mRNA 的表达，其中在卵巢组织中的表达量最高，在下丘脑中最低，而且该研究还发现在黔北麻羊的卵巢组织中，多羔组基因的表达量显著高于单羔组。Rajesh 等研究发现，和基因可刺激雌激素的产生并且促进水牛卵巢卵泡中颗粒细胞的存活。还有研究发现，基因可以促进鸡原始生殖细胞的生成。上述结果均表明，基因对雌性动物产羔性能的作用十分重要。

本研究发现，基因的g.63454744T＞G 位点在5 个绵羊群体中均表现为低度多态（PIC＜0.25），表明该位点在上述绵羊群体中具有较小的选择潜力。经卡方适合性检验分析，该位点在5 个绵羊群体中均处于哈代-温伯格平衡状态（＞0.05），说明该位点具有适应性较强的优势。进一步与产羔数关联分析发现，该位点不同基因型之间均与产羔数无显著差异（＞0.05），即该位点不适用于上述5 个绵羊群体多羔性状的选育。

3.3基因与产羔性能的关系对动物繁殖性能具有重要的调控作用，在卵巢组织中的表达水平以及基因多态性均与家畜的繁殖力有关。研究发现，洛克猪和豫南黑猪群体外显子区存在T98C 位点多态位点，AA 型个体的总产仔数显著高于AB 型；苏淮猪基因3'-UTR 区c.*273A＞G，其多态性与产仔数性状显著关联，AA 型个体产仔数高于GG 型。在绵羊群体中，基因对产羔性能的影响也有研究，Χu 等发现湖羊多羔母羊卵泡中的mRNA 表达量显著高于单羔个体；张壮彪等发现基因在繁殖性能高的小尾寒羊输卵管、卵巢、下丘脑、垂体、大脑中的表达量均高于苏尼特羊；Zhang 等发现小尾寒羊的基因启动子区g.58171886A＞C 突变位点多态性与产羔性状显著关联，CC 型个体产羔数显著高于AC 型和AA 型。上述结果表明，基因对绵羊产羔性能的影响非常重要，可作为绵羊繁殖性状的候选基因。

本研究发现，基因的g.58171856C＞G 位点在5 个绵羊群体中均表现为低度多态（PIC＜0.25），表明该位点在上述绵羊群体中具有较小的选择潜力。经卡方适合性检验分析，该位点在5 个绵羊群体均处于哈代-温伯格平衡状态（＞0.05），说明该位点在选择过程中适应性较强。进一步与产羔数关联分析发现，该位点不同基因型之间均与产羔数无显著差异，即该位点不适用于上述5 个绵羊群体多羔性状的选育，这与上述讨论结果存在差异，可能原因是所选群体不同造成的。