三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯对断奶仔猪空肠基因表达的影响

时间：2024-05-30

田俊杰，李抗，王帅杰，谭子涵，汪曼丽，宁楠，王蕾,2，赵迪,2，郭双双,2，侯永清,2*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，湖北武汉 430023）

短链甘油三酯是指由1 个甘油和3 个短链脂肪酸经过酯化形成的三酰甘油酯，在维持仔猪肠道形态结构和功能方面有着重要的作用。一般把含有1～6 个碳原子组成碳链的脂肪酸称为短链脂肪酸，食用后过胃而不分解，进入肠道后在胰脂肪酶和胆汁的相互作用下形成水溶性的乳糜微粒，然后缓慢释放出对应的短链脂肪酸和甘油。在不添加外源短链脂肪酸的情况下，短链脂肪酸是单胃动物大肠细菌代谢的主要终产物，主要由厌氧微生物发酵难消化的碳水化合物而产生。短链脂肪酸被肠道快速吸收，既能储存能量又能降低渗透压。短链脂肪酸对维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态结构功能具有非常重要的作用。短链脂肪酸还能增强肠道对Na的吸收。Macia 等研究表明，短链脂肪酸可以调节胃肠道的pH，缓解断奶产生的肠道屏障功能损伤，抑制有害菌的生长和促进益生菌的生长，具有免疫调节作用。也有研究证明，短期静脉注射短链脂肪酸可以促进结肠细胞增殖，三己酸甘油酯具有良好的水溶性，非肠道注射时也可以在小肠内迅速水解。日粮中添加乳酸可以有效抑制致病菌的生长，促进仔猪肠道发育。三乳酸甘油酯在胃肠道中分解为乳酸和甘油，是很好的肠道乳酸来源。短链脂肪酸酯作为短链脂肪酸的供应形式，是具有广阔开发前景的饲料添加剂。本实验室前期研究结果表明，日粮中添加0.5%三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯对断奶仔猪的生长性能没有显著影响，但是降低了腹泻率。本研究采用基因芯片技术和RT-qPCR 法分析了三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯对断奶仔猪空肠黏膜基因表达的调控作用，为其在实际生产中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯（纯度均为95%）为市售产品，试验日粮购于武汉新农翔饲料有限公司。断奶仔猪购于武汉绿色巨农农牧股份有限公司黄陂分公司。

1.2 试验设计和日粮选取24 头（21±2）日龄、体重（6.20±0.45）kg 的健康杜× 长× 大断奶仔猪，按单因素试验设计随机分为3 组，每组8 个重复，每个重复1头猪。对照组饲喂基础日粮，三己酸甘油酯组和三乳酸甘油酯组分别在基础日粮中添加0.5%三己酸甘油酯和0.5%三乳酸甘油酯。基础日粮参照NRC（1998）猪的营养需要（8～20 kg）配制，日粮的组成及营养成分见表1。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础）

1.3 饲养管理进猪前对栏舍进行打扫、消毒和熏蒸。整个试验期间猪舍室内温度保持在22～25℃，仔猪在不锈钢代谢笼中单笼饲养，舍顶有通风扇定时通风，自由采食，鸭嘴式饮水器自动供水，养殖期间猪舍定期每天定时清扫，早、晚各消毒1 次。

1.4 样品采集在试验第21 天，每头猪按照80 mg/kg体重的剂量注射10% 戊巴比妥钠进行麻醉。屠宰后立即取空肠中间长约10 cm 的肠段，用预冷的生理盐水将肠黏膜轻轻冲洗，然后用无菌载玻片刮取肠黏膜，分装在无RNA 酶的1.5 mL EP 管中，立即投入液氮速冻，再转移至-80℃超低温冰箱中保存待测。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 空肠黏膜总RNA 的提取将空肠黏膜在液氮中研磨，取约100 mg 样品，按照RNAiso Plus（TaKaRa，大连）试剂的提取说明书操作，提取总RNA。用Nanodrop ND-2000 UV-VIS 核酸蛋白检测仪在波长260 nm 下检测RNA 的浓度，吸光值A/A的范围为1.8～2.2。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳验证RNA 的完整性（28S/18S rRNA ≥1.8）。

1.5.2 基因芯片分析依照Agilent 基因表达谱芯片（单标）操作指南，对总RNA 进行纯化，将OD/OD约为2.0 且未降解的样本生成标记靶标，按照Afymetrix WT（Afymetrix,Santa Clara，CA，USA）加标记分析方法用纯化的总RNA 合成含有标记的单链片段cDNA（100～500 ng）。cDNA 作为模板与猪的基因芯片在48℃下杂交20 h 后，流体工作站清洗阵列，然后在GeneAtlas 系统中的成像工作站扫描阵列。扫描后，利用Afymetrix 命令控制台软件1.4 版从图像数据中提取猪基因芯片的强度数据，然后用Afymetrix 转录组分析控制台软件4.0 对基因表达谱和基因进行归一化分析。在差异显著性＜0.05 的情况下，以差异倍数（Fold Change，FC）≥1.5 为标准选筛选差异基因。其次，构建韦恩图用于比较各处理组间的差异表达基因数量。再次，用 Reactome Pathway Database（https://reactome.org/）对差异表达基因进行KEGG 富集分析，获得被显著影响的前10 个信号通路。

1.5.3 实时荧光定量PCR 法测定基因表达总RNA 的提取方法如1.5.1 所述，RNA 反转录参照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大连）试剂盒的说明书进行。合成cDNA 后使用实时荧光定量PCR的方法对相关的基因进行检测。以RPL4 为内参基因，各基因的相对表达量通过归一法以相对于对照组的表达量表示。检测基因：①细胞生长相关基因为双链RNA依赖性蛋白激酶（）、蛋白激酶B（）、表皮生长因子（）；②炎症和病毒相关基因为c-Jun 氨基末端激酶（）、干扰素-（-）、白细胞介素（）、干扰素诱导因子（）；③物质转运相关基因为囊性纤维化跨膜转导调节因子（）、钠-葡萄糖转运子（）、钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白（）。检测基因所需的引物（表2）由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表2 RT-qPCR 法中基因的引物序列

1.6 统计分析采用SPSS 20.0 统计软件中的单因素方差分析进行组间分析，当差异显著时用Duncan's 多重比较进行分析。以＜0.05 为显著性判断标准，试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 基因表达谱分析如图1 所示，与对照组相比，三己酸甘油酯组有71 个差异表达基因，其中46 个上调基因，25 个下调基因；三乳酸甘油酯组有40 个差异基因，其中11 个基因上调，29 个基因下调。2 组共有的上调基因有3 个，下调基因有4 个。各组前10 个差异表达的基因见表3～6。三己酸甘油酯组主要上调了与物质转运相关的基因（如等），下调了细胞氨基酸及其衍生物代谢（如等）和脂类代谢相关（如等）的基因。三乳酸甘油酯组主要上调了与细胞免疫（如等）相关的基因，下调了细胞氨基酸及其衍生物代谢（如等）和信号转导（如等）相关的基因。

表3 三己酸甘油酯组前10 个差异上调表达基因

图1 差异表达基因的韦恩图（A 为上调基因，B 为下调基因）

2.2 信号通路的聚类分析如图2 所示，三己酸甘油酯组差异表达基因参与的信号通路主要集中在脂类代谢、一氧化氮代谢、细胞氨基酸及其衍生物的代谢、细胞免疫等方面。三乳酸甘油酯组的差异表达基因未富集出信号通路。

图2 三己酸甘油酯组差异表达基因的富集分析

2.3 利用RT-qPCR 法检测空肠基因的表达如表7 所示，与对照组相比，三己酸甘油上调了空肠的 mRNA 水平（＜0.05)，下调了空肠-的mRNA 水平（＜0.05）；三乳酸甘油酯组上调了空肠和的mRNA 水平（＜0.05)，下调了空肠-的mRNA 水平。

表7 三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯对空肠相关基因mRNA 表达量的影响

3 讨论

肠道不仅是消化代谢的场所，还关系着仔猪的健康，维持肠道的健康状态对仔猪的生长发育具有重要意义。本课题组前期研究已经证实，三乳酸甘油酯和三己酸甘油酯对仔猪肠道黏膜屏障、免疫等功能具有很好的保护作用。本次试验在前期研究的基础上继续探究三乳酸甘油酯和三己酸甘油酯对仔猪肠道的作用机制。三乳酸甘油酯通常被作为饲料酸化剂而广泛使用，在肠道中被分解为乳酸继续参与肠道代谢循环。乳酸有利于家畜和家禽特别是幼龄动物的生长，乳酸主要作为饲料中的酸化剂，激活消化酶，促进肠道的消化和发育。三己酸甘油酯容易被肠道吸收，在小肠中分解为甘油和己酸，它们可以作为燃料为肠道的各种生理活动提供能量，还可以降低肠道渗透压，促进肠道对钠离子的吸收。己酸具有良好的脂溶性，可以破坏肠道中有害病菌的细胞膜，发挥重要的抗菌作用。Wu 等研究表明，日粮中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯可以增加仔猪肠道吸收功能（提高了水通道蛋白8 和10 基因的表达量）、增强了抗氧化免疫能力（核因子E2 相关因子2、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和谷胱甘肽过氧化物酶的基因表达量上调）和上皮细胞的生长和存活能力。本试验基因芯片结果显示，短链脂肪酸甘油酯主要影响了空肠脂类代谢、细胞氨基酸及其衍生物的代谢、物质转运、信号转导以及免疫和疾病相关的生物过程，表明三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯对仔猪的空肠脂质代谢、免疫和物质转运等重要功能发挥了调控作用。本试验KEGG富集结果也显示，差异基因主要参与脂类代谢、细胞氨基酸及其衍生物的代谢、转录、信号转导和能量代谢等生物过程，这可能是三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯对仔猪肠道健康发挥调控作用的关键途径。

表4 三己酸甘油酯组前10 个差异下调表达基因

表5 三乳酸甘油酯组前10 个差异上调表达基因

表6 三乳酸甘油酯组前10 个差异下调表达基因

正常情况下，与其受体结合从而激活酪蛋白激酶，发挥其生物功能，如促进细胞生长、细胞增殖、营养物质转运等。Yang 等研究表明，可以促进小猪空肠肽转运载体的表达。本研究结果表明，日粮中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯，上调了空肠基因的表达，这可能会促进肠道小肽的吸收，改善仔猪生长。基因的上调可以激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化来调控肠道细胞的生长、增殖和凋亡。三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯通过上调仔猪空肠基因对肠道能量代谢和物质转运方面有积极作用。

在调控仔猪肥胖和脂肪代谢方面具有重要作用。研究表明，会在高糖高脂和炎症因子的刺激下提高表达量，从而影响胰岛因子的转导。本研究结果表明，日粮中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯上调了基因的表达。的高表达可以抑制蛋白质的合成来达到抑制病毒表达的目的，可以作为细胞防御病毒入侵的第一道防线，缓解病毒给仔猪肠道带来的损伤。是细胞由正常状态向病理状态转变过程中的一个重要的调节激酶，既能促进细胞增殖也能促进细胞凋亡。本研究中，三己酸甘油酯或三乳酸甘油酯的添加上调了基因的表达，这表明它们可能通过对空肠细胞生长增殖以及免疫功能的调控来维持仔猪肠道的健康。家族的主要功能是抗病毒感染，而被认为是病毒诱发的负反馈调节和细胞抗病毒应答的主要调控基因。有研究表明，高表达的可抑制细胞的翻译，从而抵御病毒的增殖和侵袭。和-在病毒入侵引起的感染和炎症反应中起重要作用。可以提高中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性，可以干扰病毒复制，特异性杀伤病毒感染的细胞。本研究表明，三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯上调和下调-以及三乳酸甘油酯上调可能是其提高断奶仔猪抗病毒能力的一种作用途径。

KEGG 富集分析和RT-qPCR 分析的结果显示，日粮中添加三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯调控了物质转运相关基因的表达。氨基酸作为仔猪生长必需的物质，不管在营养还是生理意义上都是必不可少的。是一种广谱氨基酸转运载体，可以转运多种中性氨基酸。越来越多的研究表明，不仅能作为氨基酸的转运载体，还可以调节许多体内的代谢活动，如作为主要的氮转运载体参加氧化代谢，调节细胞内参与合成代谢的氨基酸浓度等。本研究中，三己酸甘油酯和三乳酸甘油酯上调了基因表达，这表明2 种添加剂促进了仔猪肠道氨基酸的转运和代谢。李红宇等研究表明，可以调节脂肪酸合成因子的表达，影响体内脂质的生成过程。葡萄糖更是机体不可或缺的重要物质，本研究中，三己酸甘油酯上调了的表达，这表明它可促进肠道葡萄糖的吸收，提高能量摄取水平。葡萄糖转运、利用和吸收效率的提升可以更好地促进仔猪生长。