光照通过褪黑素影响浙东白鹅肌肉生长发育的研究

沈龙仙，张 晨，汪 涵，袁琼雨，杨松柏，周晓龙，赵阿勇

（浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江临安 311300）

光作为一种非生物因素，会影响动物的生长速率、代谢活动、性成熟和繁殖等，对大多数生物的生命有重要作用。延长日照时间可以增加鱼类的生长速度[1]、影响肉鸡的采食量和生长率，也会影响骨骼系统疾病的发生率[2]。肌肉的生长发育受一系列生肌决定因子时空上的精密调控，根据这些因子的结构和作用模式可以分为相对独立的家族，如生肌调控因子家族（MRFs）、肌细胞特异性增强因子2 家族（MEF2）、转化因子β超家族（TGF-β）、配对框家族（Pax）等。然而，关于光照管理技术对肌肉生长发育的影响少有报道，其相关的作用机制还需要进一步研究。

鹅属于季节性繁殖动物，光照对其影响很大。合适的光照程序可以通过延长产蛋期和缩短休产期来提高鹅的产蛋性能[3]。研究发现，不同光照组之间的肌肉特异性基因表达会发生变化，表明鱼类肌肉生长过程的调控机制依赖于光周期的持续时间[1]。因此，推测光照可能会影响浙东白鹅肌肉的生长发育。MLT 是一种由松果体分泌的多功能吲哚类激素，其分泌具有昼夜节律和季节性节律，并且对光照非常敏感。本试验检测了浙东白鹅在不同光照模式下的血清MLT 含量，通过实时荧光定量PCR 技术分析肌肉特异性基因表达的变化，发现MLT 含量发生了显著变化，因此在C2C12 细胞上开展了一系列初步实验验证MLT 对肌肉特异性基因的作用，为进一步提高家禽生长性能和促进肌肉生长发育提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料 总RNA 提取试剂Trizol（北京康为世纪生物科技有限公司）；反转录试剂盒 5X All-In-One RT Master Mix（南京曼夫特生物科技有限公司）；SYBR®Premix Ex TaqTM II 试剂盒（新贝生物科技有限公司）；C2C12 细胞（浙江农林大学动物遗传育种与繁殖实验室）；磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基（HyClone 公司）；胰酶（0.25%Trypsin-EDTA 1X，Thermo Fisher 公司）；12 孔板和细胞培养皿（杭州昊鑫生物科技有限公司）。

1.2 动物试验 试验持续时间为2 个月，选取32 周龄体型大小相似、体况良好的浙东白鹅母鹅16 只，随机分成2 组，每组8 只。2 个试验组分别接受长光照（15L:9D）和短光照（9L:15D）。按正常的饲养管理模式进行，内设饮水器，每天喂料2 次（07:00 和17:00）。尽量保持舍内卫生、干燥。自由采食、自由饮水。在40 周龄对其进行屠宰，每组随机抽取4 只鹅，取静脉血5 mL用于后续各项指标的检测。同时取所有鹅的同侧腿肌组织部位，置于液氮速冻，-80℃保存。

1.3 细胞培养实验

1.3.1 C2C12 细胞复苏及培养 细胞复苏：从液氮中迅速取出冻存的C2C12 细胞，放入提前预热至37℃的水浴锅中，不断摇晃冻存管，在快要融化的时候取出，将细胞转移至15 mL 离心管内，加入生长培养基吹打均匀，1 000 r/min 离心5 min。弃去上清液，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基重悬细胞。将其转移至10 cm 细胞培养皿中，置于含5% CO2、37℃的恒温培养箱中培养。

细胞传代：培养瓶中的C2C12 细胞贴壁面积达到80%左右时，吸弃旧培养液，用磷酸盐缓冲液PBS 清洗弃去，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞5 min 左右，加入1 mL 细胞终止液终止消化。吹打混匀后转移至15 mL离心管内，1 000 r/min 离心5 min。吸弃上清液，加入生长培养基，将细胞吹打混匀，分装至2 个10 cm 培养皿中，继续培养。

细胞铺板：待细胞融合率达到80%时，吸弃旧培养液，用磷酸盐缓冲液PBS 清洗弃去，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞5 min 左右，加入1 mL 细胞终止液终止消化。吹打混匀后转移至15 mL 离心管内，1 000 r/min离心5 min。吸弃上清液，加入生长培养基，将细胞吹打混匀，用12 孔板进行细胞铺板，将细胞分组培养在含添加不同MLT 浓度（0、0.1、1.0、10 ng/mL）的DMEM 高糖培养基中。

1.3.2 体外培养C2C12 细胞不同时期的RNA 提取 细胞铺板24 h 后收集提取各组细胞RNA，反转录后置于-20℃冻存。以GAPDH为内参基因，对肌肉发育相关基因进行荧光定量PCR 检测分析。

选择适宜的褪黑素浓度进行C2C12 细胞培养，将细胞分组培养在该浓度下的DMEM 高糖培养基中，同时设置对照组培养在无褪黑素处理的DMEM 高糖培养基中，收集提取30%、50%、70%、90%细胞融合度的细胞RNA，对其进行反转录和荧光定量PCR 操作。

1.4 总RNA 的提取和cDNA 的合成 利用Trizol 法（Trizol Reagent，Invitrogen）提取实验鹅腿肌组织的总RNA。以1% 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测RNA 的纯度和浓度，-80℃保存备用。

cDNA 的合成利用5X All-In-One RT MasterMix 反转录试剂盒（Abm，Canada）。配制反转录反应体系20 μL：5X All-In-One RT MasterMix 4 μL，RNA 1 ng，Nuclease-free H2O 加到20 μL。反应条件为25℃10 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 保存。反应完成后取出加40 μL dd H2O 稀释，-20℃保存。

1.5 引物设计与合成 根据NCBI 公布的mRNA 序列，采用Primer Premier 5.0 软件对肌肉特异性相关基因以及内参基因GAPDH进行引物设计（表1、2）。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1 鹅肌肉特异性基因PCR 扩增引物

1.6 实时荧光定量PCR 将反转录合成的 cDNA 模板，加入已验证好的引物，根据SYBR®Premix Ex TaqTMII 试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR 检测，每个样本重复3 次。反应体系10 μL：2×S6 Universal SYBR qPCR Mix5 μL，Forward Primer 0.25 μL，Reverse Primer 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL；qPCR 程序：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，进行 40 个循环，扩增结束后分析熔解曲线。每个样本进行3 次实时PCR 检测，取平均值。

表2 鼠肌肉特异性基因PCR 扩增引物

1.7 统计分析 本次实验以GAPDH 基因作为内参基因对检测的目的基因进行归一化，采用 2-ΔΔCt法得出不同光照时间下浙东白鹅肌肉特异性基因的相对表达量，实验数据用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，使用LSD 法进行差异显著性检验。差异显著水平设为P＜0.05。

2 结果分析

2.1 不同光照对体重和褪黑素含量的影响 如图1 所示，长光照组的平均体重为3.86 kg，较短光照组下降了14.41%（P＜0.05）。短光照组体内血清的褪黑素含量（431.29 ng/L）较长光照组（377.94 ng/L）显著提高。

图1 2 种光照制度下浙东白鹅的平均体重和血清内的褪黑素含量

2.2 光照对鹅肌肉特异性基因表达的影响 RT-qPCR 结果显示，在实验期间，所有基因的表达水平都发生了变化。由图2 可知，短光照组中Pax7、Pax3、Myf6、MSTN基因表达高于长光照组（P＞0.05），其中Myf5基因的表达高于长光照组（P＜0.05）。而长光照组中MyoG、MyoD基因的表达高于短光照组（P＞0.05）。

图2 2 种光照制度下浙东白鹅肌肉特异性基因mRNA 的表达

2.3 不同MLT 浓度处理C2C12 细胞后肌肉特异性基因的表达 图3 结果显示，Myf5基因在10 ng/mL MLT 处理组的表达低于0 ng/mL 组（P＜0.01），而且Myf6基因在10 ng/mL MLT 处理组的表达低于0 ng/mL 组（P＜0.05），其他基因在10 ng/mL MLT 处理组的表达虽然没有显著差异，但都呈下降趋势。相反，各个基因在0.1、1 ng/mL 处理组的表达与0 ng/mL 组均无显著变化。2.4 C2C12 细胞的培养 图4 显示的是细胞融合度达到30%、50%、70%、90%的10 ng/mL MLT 处理组和0 ng/mL MLT 处理组的细胞形态。图中可以看出，当细胞融合度达到70% 或90% 时，10 ng/mL MLT 处理组的细胞形态比0 ng/mL MLT 处理组的更为纤长。

图3 不同浓度处理下小鼠成肌细胞C2C12 中特异性基因的表达

图4 C2C12 细胞的增殖过程

2.5 10 ng/mL MLT 处理C2C12 细胞后肌肉特异性基因的表达谱 从图5 可以看出，细胞融合度达到30%、50%、70%、90% 时肌肉发育基因在10 ng/mL MLT 处理组的表达都低于0 ng/mL MLT 处理组（P＞0.05），结果表明在一定条件下，10 ng/mL MLT 处理对C2C12细胞中的肌肉特异性基因有抑制作用。

图5 10 ng/mL MLT 处理C2C12 细胞后肌肉特异性基因的表达谱

3 讨论

3.1 光照对浙东白鹅体重的影响 家禽的眼睛对光非常敏感，光照是影响家禽生产力表现的主要环境因素之一，而体增重是评定家禽生产性能的一项重要指标。本试验中短光照组的平均体重显著高于长光照组，与前人的试验结果不同。如王秋菊等[4]试验表明，长日照对东北白鹅公鹅总增重没有显著影响，但对东北白鹅和浙东白鹅的总增重有显著的促进增长作用。Schwean-Lardner 等[5]研究发现，23 h 光照饲养下肉鸡的体增重小于17 h 光照饲养下的肉鸡体增重，说明延长光照时间不一定促进家禽生长。也有研究发现不同光照时间不会影响家禽体重。石雷等[6]研究证实，4 种光照节律下的肉鸡平均体增重无显著差异，可能是因为长时间的光照使肉鸡兴奋性增强，加大活动力度，从而导致体增重的差异。另外，不同的研究学者采取的试验条件不同，包括品种、光照时间和恒定光强度的选择，以及季节导致的温度差异均会影响试验结果。研究表明，不同鸡种体重存在显著差异，其肌肉中骨骼肌卫星细胞的数量及细胞大小也有显著差异，且骨骼肌卫星细胞分化也有显著差异[7]。

3.2 褪黑素、光照对浙东白鹅肌肉生长发育的影响 从上述结果可以看出，长光照组的平均体重和血清中MLT 含量均显著低于短光照组，表明光照对浙东白鹅的体重和体内MLT 含量有显著影响。研究发现松果体能将光信号转换为褪黑素信号，进而调节动物机体的免疫、激素的合成以及生殖等生理活动，并且光周期、光强度和光波长均能影响家禽MLT 的分泌[8]。Calvo-Guirado 等[9]研究表明，MLT 可以促进大鼠胫骨植入中新骨的生长。Natalia 等[10]研究表明，添加10～100 ng/mL MLT 可以促进鸡胚原代卫星细胞的增殖。以上数据表明，MLT 对肌肉生长发育有显著影响。

3.3 光照对浙东白鹅肌肉特异性基因表达的影响MRFs 包 括Myf5、MyoD、Myf6或MRF4和MyoG，其中Myf5和MyoD主要参与成肌细胞的增殖；MyoG在胎儿发育中起作用，并且主要在分化末期表达；而Myf6主要在出生后表达，参与肌细胞的最终分化及肌纤维的维持。Pax3和Pax7同属于Pax基因家族的第三亚家族，是生肌过程中主要的上游调控因子。Pax3主要调控早期胚胎的肌发生，而Pax7主要与肌肉损伤的修复有关，在这两个过程中另一方扮演辅助角色。肌肉生长抑制素（MSTN）为TGF-β超家族成员，对骨骼肌生长起负调控作用。成年家畜的肌肉生长能力在胚胎时期就已决定[11]。但这些生肌决定因子的相关机制仍未不清楚。

肌肉的生长发育受上述因子调控，同时这些因子也存在广泛的相关性。陈禧[12]研究发现，在出生后母鸭胸肌中，Pax3、Pax7、MyoD和Myf5具有广泛的相关性，几乎任意两基因的表达水平均呈显著或极显著相关。Pax7基因与Pax3基因相互作用，通过诱导MyoD和Myf5基因的表达来参与骨骼肌的发育[13]。研究表明，MyoD和Myf5之间可能存在负反馈调节，Myf5促进MyoD基因的表达，而MyoD又抑制Myf5基因的表达[14]。在MyoG缺失的动物肌肉中Myf6 水平显著增加，这在一定程度上具有代偿作用[15]。因此本试验中肌肉特异性基因表达的变化结果应该结合起来分析，长光照组中Myf5基因的表达显著降低，而MyoD的表达在长光照组有上升趋势但并不显著，与前人结果类似[14]。而且Myf6基因的表达在长光照组有下降趋势，MyoG基因在长光照组有上升趋势，本试验推测两者之间可能存在代偿作用。目前关于肌肉特异性基因功能的研究尚不清楚，还需要进一步探索。

骨骼肌快肌和慢肌的上游调节因子Pax7和Pax3是重要的肌源性诱导物，在骨骼肌的发展和更新过程中起重要作用。Pax7基因是一个重要的转录因子，可调控骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。Pax7与肌肉的生长和修复密切相关，在卫星细胞的特化、增殖和激活过程中都有表达[16]。研究证实Pax3的持续表达可以抑制肌细胞分化，表明Pax3表达下降是成肌过程持续进行的必要步骤[12]。Pax3对胚胎期动物四肢的正常生长和发育至关重要，而Pax7更倾向于参与骨骼肌损伤修复的过程[17]。可能是因为Pax7、Pax3分别在骨骼肌损伤修复和胚胎发育期起作用，在生长后期两者的表达会下调，因此本试验中Pax7、Pax3基因的表达并没有受光照调控的趋势。

研究发现Myf5在脊椎动物的生肌过程中扮演重要角色[18]。其表达水平通常在孵化时最高，然后随年龄增加而下降[19]。本试验中，长光照组中Myf5基因的表达较短光照组显著下调，表明光照对Myf5基因的表达有显著影响。Myf6基因主要参与出生后肌肉分化的过程，并在成肌细胞的持续分化过程中起重要的调控作用，且在整个生长过程中保持相对较高的表达水平[20]。本试验中，Myf6基因的表达相对其他基因呈现出较高的表达水平，但长光照组和短光照组的Myf6基因表达没有显著差异，可能是因为Myf6基因的表达不受肌肉类型、年龄和品种的影响[21]。

MyoG在成肌细胞融合为肌纤维的过程中起调节作用，是肌细胞终末分化的关键因子。Patruno 等[22]研究了长白猪在胚胎期高表达MyoG，出生后呈低表达的稳定趋势。需要考虑的是，在不同种类的动物中，同种动物的不同发育时期，同种动物的不同类型的肌肉组织，同种细胞的不同状态下MyoG基因转录水平的表达具有不同规律[23]。目前MyoG在禽类胚胎发育过程中肌肉组织中的发育性表达特性的研究比较少。本研究中长光照组MyoG基因的表达略高于短光照组，但没有显著趋势，鉴于MyoG基因在鹅早期增重发挥调控作用[24]，猜测MyoG基因在浙东白鹅产蛋期的表达水平可能已经稳定，并且不受光照影响。

MyoD能促进各种类型细胞转化为成肌细胞，是肌肉组织形成的调节决定因子。肌肉中MyoD与Myf5表达相似，都是先升高后降低[25]。MyoD基因的过表达会抑制成肌细胞的增殖，并促进成肌细胞分化为成熟的肌纤维细胞[26]。本试验中MyoD基因的表达在长短光照组中均不显著，表明此试验中MLT 对MyoD基因表达没有影响。

MSTN是一种对骨骼肌生长具有负调控作用的细胞因子，其突变或缺失会导致肌细胞增生和肌纤维肥大[27]。研究报道，肌肉生长性状表现迥异的蛋鸡和肉鸡MSTNmRNA 表达量并无明显差异，表明单一个MSTN基因不足以解释禽类机体正常生长过程中肌肉的生长情况，而应与其他基因结合分析[28]。研究发现，MRFs 家族不同成员在肌肉生长时先后表达，促进肌细胞增殖、分化，而MSTN可通过调控MRFs 抑制肌肉生长发育[29]。本试验中，MSTN基因的表达水平相对较低，MRFs 家族的成员表达水平较高，表明机体可能处于促进肌肉生长发育的趋势。王钱保[30]研究证实，淮南麻黄鸡的MSTN基因表达量与体重呈显著负相关。Zhang 等[31]研究显示，MSTN基因的多态性对边鸡6～18 周龄的体重有显著影响。本试验中MSTN基因在长光照组中的表达略低于短光照组，但无显著差异，而长光照组的体重显著低于短光照组，说明MSTN基因的表达与体重没有显著关系。

3.4 褪黑素对小鼠成肌细胞发育基因表达的影响 本研究发现10 ng/mL MLT 对C2C12 细胞中的肌肉特异性基因有抑制作用。有研究表明在C2C12 成肌细胞系中添加1～2 mmol/L 褪黑素能诱导自噬从而降低MyoD[32]。但本试验结果显示，在C2C12 细胞中添加MLT 并没有显著降低MyoD基因的表达水平，可能是因为浓度不一，或是自噬导致的MyoD的下调所致。后续试验将利用浙东白鹅腿肌细胞进行不同的MLT 浓度处理实验，并且在之前细胞增殖实验的基础上再增加骨骼肌卫星细胞的分化实验，进一步探测各个基因的相关调控机制。

4 结论

本研究发现Myf5基因在长光照组中呈显著下调趋势，其他基因没有显著变化；C2C12 细胞培养实验中发现添加适宜浓度（10 ng/mL）的MLT 对肌肉特异性基因有抑制作用；Myf5基因在10 ng/mL MLT 组的表达极显著低于0 ng/mL MLT 组，Myf5基因可能是光照通过褪黑素影响肌肉发育的一个关键基因，其他基因的作用需要进一步研究。