不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌区系的比较分析

时间：2024-05-30

聂召龙，王音，潘浩，刘书杰，孙璐，冯宇哲，张晓卫，崔占鸿*

（1.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016；2.青海省牦牛工程技术研究中心，青海西宁 810016；3.青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海西宁 810016）

牦牛是青藏高原及其邻近地区的大型反刍动物，主要分布在海拔3 000 m 以上。目前我国牦牛约1 600 万头，占世界牦牛数量的95% 以上，主要分布在新疆、西藏、青海、甘肃、四川、云南等地[1-2]。青海省是我国最大的牦牛饲养大省，占全国牦牛总数的40%。牦牛可提供牛奶、肉及可制成织物的毛发[3-4]。对于牦牛而言，幼年期是从断奶到性成熟（0.5～2 岁），牦犊牛从母乳喂养过渡到采食饲料，且采食量增加，消化能力增强。牦牛在2～4 岁时生长发育接近成熟，体型基本固定，绝对增重达到峰值。动物成年期是指从生理成熟到开始衰老（4～8 岁），成年牦牛组织器官发达，生理功能成熟，代谢水平稳定，生产性能最高，是利用牦牛的最佳时机[5]。

反刍动物以木质纤维素副产品为食，如谷物秸秆、树叶和油籽饼。瘤胃中含有的复杂微生物群落对有效利用复杂的植物材料起关键作用[6]。瘤胃细菌对反刍动物的健康和饲料效率的提高至关重要，细菌组成结构会随着年龄的变化而变化[7-8]。然而，牦牛瘤胃细菌区系随年龄变化的动态尚不清楚。基于此，本研究采用16S rRNA测序技术分析不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌区系，为牦牛瘤胃微生态平衡的调控和饲养管理提供重要依据。

临床上面对“镜面人”这类罕见病例，外科医生手术治疗应站在内脏器官反位的角度去思考和操作，并精细分辨除脏器反位以外的解剖结构变异，积累经验，提高诊治能力。

1 材料与方法

1.1 动物分组、饲养管理和取样在青海省玉树州歇武镇的同一牧场中，从5 月龄、1.5 岁、2.5 岁和3.5 岁4组健康的雄性牦牛中，各选取体重相近的牦牛6 头，其中5 月龄组、1.5 岁组、2.5 岁组和3.5 岁组的平均体重分别为（58.30±4.29）、（119.40±5.82）、（156.50±8.78）、（189.4±13.69）kg。5 月龄牦牛吃少量母乳，其他牦牛自由放牧，采食牧草。该区域位于东经96°53' 和北纬34°56'范围内，平均海拔4 500 m，年平均温度为-1.6℃。

通过观察牦牛采食牧草的情况，采集天然牧草样品。样品送青海省畜牧兽医科学院青海省高原牦牛工程技术研究中心实验室进行营养成分分析，测得灰分含量5.32%（风干基础），粗蛋白含量11.28%，粗脂肪3.66%，中性洗涤纤维42.70%，酸性洗涤纤维31.73%，钙0.31%，磷0.17%，钙/磷比为1.96。

上午人工挤奶，每头母牦牛取3 个样品，获得约500 mL 牛奶用于化学分析。所有牛奶样品在冰上保存约4 h，并在到达实验室后立即进行分析，测得干物质含量为16.68%，粗蛋白质为4.71%，粗脂肪为5.25%，乳糖5.57%，全乳固体11.41%。

于2019 年9 月27 日—9 月30 日收集瘤胃液。禁食约8 h 后，牦牛被固定在限制槽中收集瘤胃液。然后将每头牦牛的瘤胃液收集到2 个5 mL 的无菌冻存管中，投入液氮中下保存，提取DNA。

了解侍酒师工作的人都知道，常常一天12小时的高强度工作就已是个极大挑战，但他却在还一直坚持学习，并参加了国内外至少6场侍酒师比赛，拿了不下4个冠军，直到2014年10月23日在“大中华侍酒师大赛”中拔得头筹，才遂了这桩心愿。但与此同时，他似乎还干了很多不务正业的事情，比如说跑去教授WSET课程，比如说翻译和撰稿。

除了时间状语之外，说话者对历史事件的追溯在时间层面上也发挥重要作用。尽管这类事件没有出现具体时间节点，并且发生在遥远的过去，但重大历史事件往往会给人留下深刻印象。说话者往往会直接引用历史事件并且省略具体时间，从而使得原本处于时间轴末端的实体向指示中心趋近。例如：

用通用引物V338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'）和V806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）对微生物基因组总DNA 的16S rRNA V3-V4 区进行PCR 扩增。PCR 反应体系（20 μL）：上、下引物（10 μmol/L）各0.8 μL，10 ng 模板DNA，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.4 μL Fastpfu 聚合酶和4 μL 5×Fastpfu 缓冲液，最后加ddH2O 至20 μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30 个循环；将相同体积的1× 缓冲液（含SYBR Green I ）与PCR 产物混合，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。选择条带亮度在400～450 bp 的样品进一步实验。PCR产物以等密度比混合。然后，用德国桥根凝胶提取试剂盒对PCR 产物进行纯化。在诺禾致源生物技术公司的Illumina MiSeq 平台上对细菌扩增子进行测序。

根据样本的唯一条形码将单端读取序列与样本对比，并通过切断条形码和底漆序列来截断。根据Cutadapt[9]质量控制过程，在特定的过滤条件下对原始读数进行质量过滤，以获得高质量的干净读数。使用UCHIME 算法（UCHIME Algorithm）[10]将读取的数据与参考数据库（Silva Database）[11]进行比较，以检测嵌合体序列，然后去除嵌合体序列[12]。最后得到读数。

1.3 序列及多样性分析基因序列文库使用离子加片段库工具包48 rxns（Thermo Scientific）生成，建库质量采用Qubit@2.0 荧光计（Thermo Scientific）评估。最后，在离子S5TM XL 平台上对该文库进行测序，得到400 bp/600 bp 的单端读数。

“花儿”，亦称“少年”，因歌词中将青年女子比喻为“花儿”而得名。它是主要流行于甘、青、宁、新四省区的一种民歌，深受汉、回、藏、土、东乡、保安、撒拉、裕固八个民族人民的喜爱，唱词浩繁，文学艺术价值极高，被称为“西北之魂”[1]。2006年，“花儿”被确定为首批国家级非物质文化遗产保护项目，2009年又列入了世界非物质文化遗产保护名录[2]。要让“花儿”的民俗文化走出去，翻译是关键；要做好翻译，首先应该厘定“花儿”英译的本质属性，然后依据其本质属性提出科学合理的英译模式、策略与方法。

应用α多样性方法，通过Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Good-coverage 6个指标分析样本物种多样性的复杂性。这些指标都是用QIIME（1.7.0 版）计算，并用R 软件显示。

用β多样性分析评价物种复杂度的差异，用QIIME软件（1.7.0 版）计算加权和未加权Unifrac 的β多样性。在聚类分析之前先进行主成分分析（PCA），在R 软件（版本2.15.3）中使用FactoMineR 包和ggplot2 包降低原始变量的维数。通过主坐标分析（PCoA）从复杂的多维数据中获取主坐标并可视化。将之前得到的样本间加权或未加权均匀度的距离矩阵变换为一组新的正交轴，通过这些正交轴，第一主坐标表示最大变异系数，第二主坐标表示第二最大变异系数，依此类推。PCoA分析由R 软件（2.15.3 版）中的WGCNA 包、stat 包和ggplot2 包显示。采用算术平均聚类法（UPGMA）对距离矩阵进行层次聚类，并用QIIME 软件（1.7.0 版）进行聚类分析。

2.4 不同年龄牦牛瘤胃细菌的聚类差异分析 PCoA 结果（图6）显示，3.5 岁组与5 月龄组的细菌群落有明显差异，PC1 差异占总变异的27.45%，PC2 差异占总变异的26.88%。此外，瘤胃细菌群落随着年龄的增加而逐渐变化，5 月龄组和3.5 岁组几乎成为2 个不同的群落。

1.2 DNA 提取与PCR 扩增冷冻样品在冰上解冻，在涡流混合器中均匀混合。用CTAB/SDS 法提取样品总基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶上监测DNA 浓度和纯度。根据浓度，用ddH2O 稀释DNA 至1 ng/μL。

1.5 统计分析数据采用Excel 进行初步整理，并用SPSS 20.0 软件进行数据独立性、正态性和方差齐性检验，满足方差分析条件后，进行ANOVA 单因素方差分析，差异显著时用Duncan's 法进行多重比较，以P＜0.05 为差异显著的判断标准。数据结果为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同年龄牦牛瘤胃细菌Mothur 与Alpha 多样性分析结果总体而言，在3% 的距离上，从24 个不同的样本总共获得3 236 个OTU 中，每个样本的平均OTU为1 816.38 个。此外，本报告共分析了24 个不同样本的1 218 479 个有效序列。稀疏分析显示了大量不同的样品。具有97% 相似性的稀疏曲线也表明足够的测序覆盖率可以解释每个样本中的大多数细菌多样性（图1）。覆盖指数大于99%表明微生物群落反映准确。此外，放牧牦牛年龄水平的增加对丰富度估计值（Ace 和Chao 1 指数）有显著影响，而多样性指数（Shannon 和Simpson 指数）的影响不显著（表1）。

为了保证二期厂房及停车场的正常修建，在勘察的基础上进行有针对性地开展边坡治理工作十分必要且非常紧迫，并根据业主一致讨论，把整个边坡范围作为本次治理范围。

表1 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌的OTU 数目和Alpha 多样性分析

图1 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌稀疏曲线图

2.2 不同年龄牦牛瘤胃细菌在门水平的优势菌群分析采用鉴定学分析方法，共检测到26 个菌门。最丰富的菌门包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、广古菌门（Euryarchaeota）、螺旋体门（Spirochaetes）（图2）。5 月龄组和1.5 岁组以拟杆菌门（分别为55.94%和54.60%）、厚壁菌门（35.89% 和36.11%）、放线菌门（2.94%和3.31%）、螺旋体门（1.26%和1.53%）和变形菌门（Proteobacteria）（0.75%和0.86%）为主。2.5岁组和3.5 岁组则以拟杆菌门（49.31 和58.24%）、厚壁菌门（35.44 和27.65%）、放线菌门（5.54 和4.00%）、广古菌门（2.57 和4.15%）和螺旋体门（1.84 和1.43%）最常见。与其他试验组相比，3.5 岁组拟杆菌的相对丰度显著增加，而厚壁菌的相对丰度则显著降低。变形菌门在5 月龄组和1.5 岁组中含量高于2.5 岁组和3.5 岁组。不同年龄组瘤胃细菌群落在门水平上有明显变化。4 个年龄组的厚壁菌门（P＜0.01）和拟杆菌门（P＜0.05）是优势菌门，在不同年龄之间存在显著差异。广古菌门相对丰度随年龄增长而呈线性增长（P＜0.01）。4 个年龄组其他各菌门均无显著性差异。图3 中列出了相对丰度前10 个细菌门。

图2 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌门水平相对丰度图

图3 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌门水平热图

2.3 不同年龄牦牛瘤胃细菌在属水平的优势菌群分析在属水平中，共检测到212 个细菌属。数据表明，最丰富的属（相对丰度超过1%）可以阐明会影响瘤胃生态系统的最重要细菌（图4）。在5 月龄组中，未分类-普雷沃氏菌属（unidentified-Prevotellaceae）（丰度为4.33%）、未分类-瘤胃球菌属（unidentified-Ruminoco ccaceae）（4.04%）、欧氏菌属（Olsenella）（2.58%）、颤螺旋菌属（Oscillospira）（2.46%）、未分类-毛螺菌属（unidentified-Lachnospiraceae）（2.45%）、未分类-韦荣氏球菌属（unidentified-Veillonellaceae）（2.40%）、未分类-拟杆菌属（unidentified-Bacteroidales）（2.26%）、未分类-理研菌属（unidentified-Rikenellaceae）（1.80%）和奎因氏菌属（Quinella）（1.49%）是优势菌属。在

序列分析采用Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）[13]。相似性≥97% 的序列被分配给相同的OTU（操作分类单元）。对每个OTU 的代表序列进行筛选，以便进一步注释。对每个有代表性的序列，Silva 数据库[11]基于Mothur 算法用于注释鉴定信息。为研究不同OTU 的系统发育关系，以及不同样本（群）中优势种的差异，利用MUSCLE 软件（3.8.31 版）[14]进行了多序列比对。OTUs 丰度信息使用与序列最少的样本对应的序列号标准进行归一化。随后的α多样性和β多样性分析均基于输出的标准化数据进行。

图4 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌属水平相对丰度图

2.5 不同年龄牦牛瘤胃细菌的代谢途径和功能预测KEGG 水平1 被认为是KEGG 鉴定中的最高水平（图7），其中鉴定代谢显示出最高的相对丰度，在每组中超过总阅读量的45%。KEGG 水平2 表明，瘤胃样品中存在35 个基因家族（相对丰度＞0.08%）（图8）。大多数基因属于膜转运（Membrane Transport）、碳水化合物代谢（Carbohydrate Metabolism）、氨基酸代谢（Amino Acid Metabolism）、复制修复（Replication and Repair）、翻译（Translation）、能量代谢（Energy Metabolism）和核苷酸代谢（Nucleotide Metabolism）。

同时，不同的年龄水平对甲烷杆菌属（P＜0.01）、颤螺旋菌属（P＜0.01）的相对丰度有显著影响。图5 列出了相对丰度前35 个细菌属。根据沿X 轴聚类显示，1.5岁、2.5 岁和3.5 岁组中的样本聚集在一起，而不包括5月龄组。

(3)推进自动化监测技术，提高监测能力。自动化监测是地下水监测的发展趋势，新建设的监测站点一般都安装了自动化监测设备，提高了监测精度和频率[13]。同时应该加快推进人工长期监测点的改建工作，提高自动化监测点比例，全面提升地下水自动监测能力和现代化水平。

图5 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌属水平热图

1.4 细菌代谢途径与功能预测 Tax4Fun 功能预测是基于最小16S rRNA 序列相似性的最近邻法，通过提取KEGG（京都基因与基因组百科全书）数据库原核全基因组16S rRNA 基因序列，并使用BLASTN 算法（BLAST Bitscore＞1500）将其与SILVA SSU Ref NR 数据库对齐来实现的建立相关矩阵，将UProC 和PAUDA 注释的KEGG 数据库的原核全基因组功能信息映射到SILVA数据库，实现SILVA 数据库功能注释。利用SILVA 数据库序列作为参考序列，将已测序的样本从OTU 中聚类出来，获得功能注释信息。

图6 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌的主坐标分析（PCoA）图

1.5 岁组中，最丰富的序列是与未分类-普雷沃氏菌属（5.36%）、瘤胃球菌属（3.35%）、未分类-毛螺菌属（3.33%）、未分类-韦荣氏球菌属（3.16%）、欧氏菌属（2.67%）、未分类-拟杆菌属（2.46%）、奎因氏菌属（2.31%）和理研菌属（1.18%）有关的序列。在2.5 岁组中，最丰富的序列是未分类-普雷沃氏菌属（5.61%）、欧氏菌属（5.02%）、奎因氏菌属（3.87%）、未分类-瘤胃球菌属（3.44%）、未分类-毛螺菌属（3.01%）、未分类-韦荣氏球菌属（2.53%）、甲烷杆菌属（Methanobrevibacter）（1.90%）、未分类的拟杆菌属（1.75%）和未分类-理研菌属（1.21%）。在3.5岁组中，最丰富的序列是未分类的拟杆菌属（4.64%）、未分类-普雷沃氏菌属（4.57%）、奎因氏菌属（4.42%）、欧氏菌属（3.56%）、甲烷杆菌属（3.34%）、未分类-韦荣氏球菌属（2.69%）、未分类-瘤胃球菌属（2.21%）、未分类-毛螺菌属（1.75%）和未分类-理研菌属（1.46%）。

图7 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌KEGG 水平1 功能预测

图8 不同年龄放牧牦牛瘤胃细菌KEGG 水平2 功能预测

3.5岁组能量代谢（P＜0.01）、代谢（P＜0.05）、其他次生代谢产物的生物合成（P＜0.01）等功能基因的表达量高于5 月龄组，而细胞运动（P＜0.05）等功能基因的表达量低于5 月龄组（图9）。3.5 岁组能量代谢（P＜0.01）、特征差（P＜0.05）、传染病（P＜0.01）的功能基因表达量高于1.5 岁组（图10）。3.5 岁组运输和分解代谢（P＜0.05）、其他次生代谢产物的生物合成（P＜0.05）、细胞生长与死亡（P＜0.05）的功能基因表达量高于2.5 岁组（图11）。

图9 使用PICRUSt 测定的0.5 岁组和3.5 岁组的KEGG 路径比较

图10 使用PICRUSt 测定的1.5 岁组和3.5 岁组的KEGG 途径比较

图11 使用PICRUSt 测定的2.5 岁组和3.5 岁组的KEGG 途径比较

3 讨论

迄今为止，已有一部分研究对牦牛瘤胃微生物的分离培养进行了描述[15]，但不同年龄牦牛的瘤胃细菌区系仍不清楚。本研究采用16S rRNA 基因序列分析技术分析了不同年龄放牧牦牛瘤胃液中的菌群丰度和多样性。瘤胃液样本呈棕绿色，稍有黏性，有腐败臭气味。

Henderson 等[16]报道，DNA 有9 种提取方法，且均能满足DNA 质量和数量的要求。因此，本研究采用CTAB/SDS 法从牦牛瘤胃液中提取DNA。本研究在瘤胃细菌种群中共检测到3 236 个OTU，大于Xue 等[17]检测到的507 个OTU。这些差异可能与每个文库中有限的16S rRNA 基因克隆数目有关，因为随着新物种的发现和最新技术或方法的出现，每个文库中的16S rRNA 基因克隆数目不断扩大。动物体内微生物群落的丰富性和多样性随着年龄的增长而增加[18-20]。本研究中，不同的年龄水平显著影响丰富度，但多样性指数的差异并不明显。本研究中1.5 岁牦牛的瘤胃菌群的丰富度估计值（ACE 和Chao 1 指数）和多样性指数（Shannon和Simpson 指数）均高于其他组，原因可能是断奶后的

蒙牛并购雅士利作为乳制品产业中规模最大的一次并购，并且是一次强强联手的双赢并购，蒙牛在并购中的税收筹划做得很好，在发现自己的缺陷之后，采取并购的形式来快速弥补，并且支付方式和融资方式也达到了一定的节税效果。为企业创造了一定的经济效益。在进行并购活动中，税收筹划应该考虑到并购过程的每一个环节，并且要充分考虑并购方和被并购方是否都得到了一定的利益，这样才可以促进并购活动的健康发展，努力实现双方利益最大化的局面。

图9为欠压补偿前各变流器输出电压的仿真结果。由图9可以看出,在没有电压补偿且线路电阻不同的情况下,公共负荷或者本地负荷在0.8 s和1.6 s时波动,各变流器输出电压在365～375 V之间,系统不能在额定电压下稳定运行。

1.5岁牦牛正处于生长发育的快速时期，胃肠道需要快速地消化吸收营养物质，瘤胃菌群更加活跃。

在哺乳动物中，微生物的分布受年龄、宿主、性别和基因型的影响[21-22]。拟杆菌门和厚壁菌门是瘤胃微生物群中最丰富的菌群。多数的拟杆菌被用来降解纤维，而大部分的厚壁菌被用来降解蛋白质和多糖[23]。此外，先前的研究表明，厚壁菌与拟杆菌的比例随着年龄的变化而变化[24]。厚壁菌门和拟杆菌门存在一种相互促进的共生关系，它们共同促进宿主吸收或储存能量，因此消化道内的拟杆菌和厚壁菌对发酵多糖非常重要，且两者比例可能更为重要，拟杆菌门增加或厚壁菌门减少或拟杆菌门与厚壁菌门的比例增加都有助于促进宿主利用能量[24]。本研究中，3.5 岁牦牛瘤胃菌群中拟杆菌的相对丰度最高，厚壁菌的相对丰度最小，且在功能预测中，能量代谢的功能基因表达量都显著高于其他年龄牦牛，表明3.5 岁牦牛能量利用率最好。

在属水平上，普雷沃氏菌属、毛螺菌属和瘤胃球菌属普遍存在于牛瘤胃的核心微生物群中[25-26]。然而，本研究中，牦牛的瘤胃中未分类的拟杆菌属相对丰度最高，且3.5 岁牦牛高于其他年龄组。拟杆菌属是产生短链脂肪酸的重要菌群[27-28]，在维持肠道菌群结构平衡方面发挥重要作用[29]。普雷沃氏菌属有很多种类，它们主要参与糖类与蛋白质的降解[30]。有研究表明，饲喂精料会使瘤胃中普雷沃氏菌属有上升的趋势[31]。马力等[32]报道，不同物候期牦牛瘤胃中的普雷沃氏菌属的相对丰度为14.38%～17.03%，本研究中放牧牦牛瘤胃中的普雷沃氏菌属相对丰度偏低。可能是由于本研究的牦牛都是处于自由放牧条件下，只采食天然牧草所致。本研究中，不同年龄放牧牦牛之间，颤螺菌属差异较大。颤螺菌属可利用宿主糖原作为能量来源，在炎症病人体内，颤螺菌属数量会显著降低，由颤螺菌属与体质指数和炎症反应的负相关性推测它可能产丁酸盐[33]。细菌定植始于出生，在宿主生长和免疫发育中起着重要作用[34-35]。一个稳定的微生物群落保护宿主免受侵入性病原体的侵害[36]，建立稳定的细菌群落在诱导稳态机制方面具有重要作用[37]。断奶对5 月龄牦牛的瘤胃微生物群落组成有很大影响，处于从母乳向以牧草为基础日粮过渡的阶段，瘤胃的消化吸收功能也处于转化和建立的过程中，瘤胃的免疫功能尚不健全，需要更多的具有免疫功能的菌属来维持瘤胃健康。另外，本研究在牦牛瘤胃中发现了大量未经鉴定和培养的菌属。这表明牦牛可能有一个更多样的瘤胃细菌区系，但只有一小部分已被检测到。