FABP5和CRABP2基因在绵羊不同组织中的mRNA表达研究

时间：2024-05-30

李宝钧，安丽霞，任端阳，乔利英，刘建华，刘文忠

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

脂肪酸结合蛋白（Fatty Acid Binding Proteins，FABPs）是胞内小分子蛋白质，可与长链脂肪酸等疏水性配体可逆性结合，调控脂质在细胞内部的转运、能量储存及相关基因表达[1]。脂肪酸结合蛋白5（Fatty Acid Binding Protein 5，FABP5）和细胞视黄酸结合蛋白 2（Cellular Retinoic Acid-Binding Protein 2，CRABP2）同属FABPs。CRABP2和FABP5均可将视黄酸（Retinoic Acid，RA）从细胞质转运至细胞核，分别与2种不同的核受体——视黄酸结合受体（Retinoic Acid Receptor，RAR）和过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor β/δ，PPARβ/δ）相互作用，在RA信号通路上发挥作用。在人类中，FABP5和CRABP2的研究多集中于肿瘤。在饲喂高脂饮食的小鼠模型中发现，CRABP2在前体脂肪细胞中激活RA/RAR通路而抑制脂肪细胞的分化；在成熟的脂肪细胞和肌肉细胞中，CRABP 2激活RA/RAR通路，而FABP5激活RA/PPARβ/δ通路，两者共同作用而促进脂质氧化和能量利用[2]。因此，在RA通路下，FABP5和CRABP2与脂肪代谢密切相关。

在畜禽中，王卓[3]对牛FABP5基因多态性及其与肉用性状的关联性进行了分析，但由于受样本数量限制，未确定FABP5多态性对牛肉用性能的关联程度；而于佳慧[4]研究表明，鸡FABP5基因多态性与屠宰性状（如腹脂率）显著关联；张庆秋等[5]研究表明，鸡FABP5在前体脂肪细胞中的表达受FABP4表达的影响。而公维华等[6]在猪中进行了CRABP2基因的定位、组织表达谱分析和SNPs鉴定研究。但在绵羊中，未见对FABP5和CRABP2基因的报道。GEO DataSets（Gene Expression Omnibus DataSets）是一个公共的功能基因组数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds），用户可以上传或下载来源于各种动物的基因表达信息。本研究结合了人和小鼠在GEO DataSets数据库中的mRNA表达数据，应用实时荧光定量PCR技术研究FABP5和CRABP2在山西肉用绵羊母本品系不同组织中的mRNA表达，为研究其在绵羊脂肪沉积中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 人和小鼠的表达数据来源及整理 FABP5和CRABP2基因在人和小鼠的脂肪、心脏、肾脏、肝、肺和肌肉6种组织的微阵列表达（Microarray Expr-ession）信息分别来自于GDS596和GDS3142。用于构建转录组GDS596的人的年龄大于20岁，每种组织有2个重复；用于构建转录组GDS3142的C57BL/6小鼠为10～12周龄，每种组织有3或4个重复。

1.2 实验动物及组织实验动物为山西肉用绵羊母本品系，该品系以夏洛来、南非肉用美利奴、考力代、小尾寒羊和本地绵羊为亲本，经复杂杂交育种培育而成，为肉用母本品系。选取相同饲养条件下的10月龄该品系去势公羊6只进行屠宰，并分别采集皮下脂肪、心脏、肾脏、肝、肺和肌肉（背最长肌）6种组织样品，快速用铝箔纸包裹，置于液氮中，随后带回实验室保存于-80℃。

1.3 总RNA提取和实时定量荧光PCR 根据TaKaRa公司总RNA提取试剂盒RNAiso Plus reagent说明书提取样品总RNA。RNA浓度用NanoDrop公司的核酸浓度测定仪检测，所有样品的OD260/280值在1.8～2.0。RNA完整性通过1.2%的凝胶电泳检测，28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍。提取的总RNA保存于-80℃。

cDNA第1链的合成参照TaKaRa公司Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒说明书。荧光定量PCR仪为App-lied Biosystems公司的7500 Fast Real-Time PCR Sy-stem，荧光定量PCR试剂盒为TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit。反应体系为 20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10.0 μL，PCR 正、反向引物各 0.8 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 模版 2.0 μL，去RNA酶超纯水6.0 μL。反应程序：预变性阶段为95℃30 s；45个循环阶段为95℃ 5 s和60℃ 34 s；熔解曲线阶段为95℃ 15s，60℃ 1 min，再以每10 s 0.5℃的速率从60℃上升到95℃。每个样品进行3次技术重复。RPL13A由于表达稳定而作为内参基因。特异性引物通过 NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心）网站的在线引物设计工具Primer-BLAST设计而成，引物序列见1。基因的mRNA相对表达量通过2-ΔΔCT方法计算得出。

1.4 统计分析运用SPSS 19.0 软件中单因素方差分析来分析FABP5和CRABP5基因分别在人、猪和绵羊各种不同组织间的表达差异性，各组织基因表达量间的差异采用Duncan´s法进行多重比较。P＜0.05表示差异显著。结果以平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 绵羊FABP5和CRABP2基因荧光定量扩增结果对FABP5、CRABP2及其内参基因RPL13A在绵羊不同组织进行mRNA定量分析，所得样品的扩增动力学曲线见图1。可以看出，扩增曲线拐点清楚，基线平整，呈良好的S型曲线，指数期明显，符合实验要求。如图2所示，目的基因和内参基因的熔解曲线均为单一峰值，且重合性好，表明PCR过程中无非特异性扩增和引物二聚体扩增，引物特异性强，定量结果可靠。

表1 实时荧光定量PCR所用引物

图1 荧光定量PCR扩增曲线

图2 荧光定量PCR熔解曲线

2.2 FABP5和CRABP2基因在人和小鼠各组织中的mRNA表达由图3可见，FABP5在人肺中的表达量最高，且与其他组织差异显著（P＜0.05）。FABP5在人肝中的表达量最低，显著低于除肾以外的其他组织（P＜0.05）。CRABP2在人的各种组织中均有表达，但差异不显著（P＞0.05）。

图3 FABP5和CRABP2基因在人和小鼠各组织的mRNA表达

FABP5在小鼠脂肪中的mRNA表达量最高，且显著高于其他组织（P＜0.05）。FABP5在小鼠肾中的表达量最低，且显著低于除肌肉以外的其他组织（P＜0.05）。CRABP2在小鼠心脏的表达量显著高于其他组织（P＜0.05），CRABP2在除心脏以外的其他组织中的表达差异不显著（P＞0.05）。

2.3 FABP5和CRABP2基因在绵羊各组织中的mRNA表达由图4可见，FABP5、CRABP2在绵羊脂肪组织中的表达量最高，显著高于其他组织（P＜0.05）。FABP5在绵羊肝中的表达量最低，显著低于心脏、肌肉和脂肪（P＜0.05）。肝是CRABP2表达量最低的器官，与脂肪、肾脏、肺和肌肉差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 FABP5和CRABP2基因的组织表达特征绵羊FABP5和CRABP2基因在所检测的组织中均有mRNA表达，且FABP5和CRABP2基因在绵羊脂肪和肌肉组织均有较高的表达，这说明绵羊FABP5和CRABP2基因的表达具有较强的组织特异性。本研究采用来源于GEO DataSets的Microarray基因表达信息，分析结果表明FABP5和CRABP2基因在人、小鼠各组织的表达模式与绵羊有差异，如FABP5在人的肺中表达量最高，而CRABP2在小鼠的心脏中表达最高，表明FABP5和CRABP2的mRNA表达有种属差异。而分析猪转录组[7]的研究发现，FABP5和CRABP2均在猪脂肪组织的表达量最高，在肝脏组织的表达量最低，此结果与本实验在绵羊中的结果相同。另一方面， FABP5和CRABP2基因在人、小鼠、猪、绵羊脂肪组织均具有较高的mRNA表达，说明FABP5和CRABP2功能的保守性。与FABP5相比，CRABP2在各组织的表达量较低。CRABP2在人肾脏中的表达量标准差较大，可能是由于该基因在肾脏样品中表达量差别较大，样品重复量偏少。本课题组前期研究发现，FABP5在绵羊皮下脂肪、尾部脂肪和肾周脂肪均有高表达，而CRABP2在皮下脂肪和尾部脂肪中表达较高，但在肾脏脂肪中表达较低[8]。这些结果提示，FABP5在绵羊各部位脂肪组织的功能可能一致，而CRABP2可能在不同的脂肪组织中具有不同的功能。

图4 FABP5和CRABP2基因在绵羊各组织的mRNA表达

3.2 FABP5和CRABP5在脂肪组织中的功能 FABP5过表达于脂肪组织的转基因小鼠，在高脂饮食饲喂后，其基础脂解作用和激素刺激的脂解作用都在增加，胰岛素敏感性下降[9-10]。在饮食型肥胖和遗传性肥胖的小鼠模型中，FABP5表达缺陷会轻微增加系统胰岛素的敏感性[10]。在FABP5表达缺陷型的脂肪细胞，胰岛素刺激的葡萄糖转运的能力增加。Wu等[11]研究表明，FABP5在视网膜色素上皮中的脂质代谢中也发挥关键作用。Ma等[12]研究发现，当内源性FABP5被敲除后，3T3-L1细胞在诱导成为脂肪细胞时，表现为活性下降，与细胞凋亡有关的caspase-3和procaspase-3活性增加，而且与脂肪细胞分化有关的PPARγ和C/EBPα的表达下调。这些结果说明，FABP5对于保持前脂肪细胞的活性是必需的。研究表明， FABP5被认为与猪的脂肪性状相关[13-14]；FABP5 基因多态位点对鸡的生长性状和生产性能（如腹脂率）也有重要的影响[4]。CRABP2在脂肪细胞分化过程中发挥抑制作用，而在成熟脂肪细胞，CRABP2与FABP5均受到RA的调控，促进脂质氧化和能量利用[2]。同一类型的脂肪酸结合蛋白由于基因复制、转录后修饰等作用，在不同物种中的功能可能存在差异[15]。上述FABP5和CRABP2基因的功能均来自于人和小鼠的研究， FABP5和CRABP2在绵羊脂肪组织中的具体功能需要进一步研究。