瘤胃投喂外源乳酸菌对奶牛胃肠道活菌比例及挥发性脂肪酸浓度的影响

郭春燕，王雅晶，纪守坤，严 慧，聂存喜，张文举*，李胜利*

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京市生鲜乳质量安全工程技术研究中心，北京 100193；3.晋中职业技术学院生物工程系，山西榆次 030600）

益生菌主要是在数量或种类上补充肠道内减少或缺乏的正常微生物，恢复肠道内的微生态平衡。研究表明，添加益生菌活菌制剂可以改善瘤胃内环境[1-3]以及改变瘤胃和后消化道纤维分解菌数量[4-5]，可提高奶牛产奶量、乳品质及饲料转化率，降低体细胞数等[6-8]。

维持瘤胃及肠道内的活菌数量是发挥消化道菌群功能的基础和保障。流式细胞术（Flow-Cytometer，FCM）能如实区分死、活细菌，从而计算出它们的比例关系[13]。随着FCM的不断完善，其广泛应用于细菌存活率检测[9-12]。本试验旨在探讨添加外源乳酸菌对奶牛瘤胃和肠道的活细菌比例及挥发性脂肪酸（VFA）的影响，为系统深入地研究益生菌的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 单菌植物乳杆菌为中国农业大学农学院微生物实验室保藏日系菌株JCM-1149，分离自泡菜；复合菌由该实验室从柳枝稷青贮料中筛选的乳酸菌复合系SGL，主要由乳杆菌属、乳球菌属和芽孢杆菌属等组成，其中南特港乳杆菌属（Lactobacillus nantensis）78.78%、植物乳杆菌属（Lactobacillus plantarum）7.92%、美洲虎乳杆菌属（Lactobacillus pantheris）5.27%、凝结芽孢杆菌属（Bacillus coagulans）4.41%和乳酸乳球菌属（Lactococcus lactis）3.31%以及其他属0.31%。将单菌和复合菌分别加工成菌粉，经平板计数后，其有效活菌数分别为8.00×109CFU/g和8.34×109CFU/g。试验开始时，对批次生产的乳酸菌菌粉进行活菌检测，其中植物乳杆菌活菌比例占到89.84%，乳酸菌复合系的活菌比例高达94.78%。

1.2 试验动物及饲粮 在北京市顺义区中地种畜良种奶牛科技园选取4头体况良好、体重相近的3胎荷斯坦干奶牛，安装永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管。待术后护理1个月后，动物机体恢复至正常状态进行试验。试验动物基础饲粮及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养成分

1.3 试验设计及饲养管理 4头瘘管牛每天09:00和21:00饲喂全混合日粮（TMR），自由采食和饮水。

试验分3期，每期正试期7 d，间隔期20 d。采用自身对照试验设计，第1期为空白对照组，第2、3期（试验组）分别在晨饲后1 h（10:00）打开瘤胃瘘管塞投喂植物乳杆菌和乳酸菌复合系菌粉。试验组连续投喂7 d，每天投菌量为80 g/头，每头牛每天饲喂活菌量分别为6.40×1011CFU/g和6.67×1011CFU/g。每期试验最后3 d连续采样，每天08:00第1次采样，每次间隔3 h，进行24 h动态采集瘤胃液、十二指肠内容物及直肠粪样。

1.4 样品采集 分别从安装的瘘管中采集瘤胃液和十二指肠内容物各50 mL，粪便由直肠直接取样约5 g。采集的瘤胃液用4层纱布过滤后，分装到无菌冻存管中；十二指肠和直肠样品直接分装于冻存管中。3个部位的样品分别分为2份：1份样品采集后立即送入实验室，按试剂盒操作说明书处理后，利用流式细胞仪测定样品中活菌比例；另1份新鲜样品分装到离心管中，其中粪便样品先溶解于水中再装入离心管中，经3 500 r/min离心10 min，取上清液于-20℃冻存，用于检测VFA。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 活 菌 Live/Dead™BacLight™Bacterial Viability Kit（L13152）试剂盒（英潍基（上海）贸易有限公司）由2种专染核酸染料SYTO-9和PI（碘化丙锭）组成，SYTO-9是一种能渗入完整的细胞膜的小分子，发绿色荧光；PI是仅能渗到细胞膜破损的菌体内的大分子，并可与SYTO-9竞争核酸着染位点，发红色荧光。经此试剂盒染色后，发绿色荧光的为活细胞，发红色荧光的为死细胞。据此，BD LSRFortessa多维高清流式细胞分析仪（美国BD公司）能在极短时间内迅速将死活细胞分辨出来，如图1（7号样品）。试验操作按照试剂盒说明书进行。活菌比例为每分钟流式细胞仪收集到的活细胞数占总细胞数的比例：

图1 流式细胞术检测活细菌和死细菌

1.5.2 VFA 应用气相色谱仪（TP-2060，北京北分天普仪器技术有限公司）参照《反刍动物营养学研究方法》[14]测定VFA浓度。

1.6 统计分析 所有数据输入Excel进行整理，采用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析，用LSD法对组间差异进行显著性检验，P＜0.05表示差异显著，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 投喂外源乳酸菌对奶牛瘤胃和十二指肠中活菌比例的影响 如表2所示，在瘤胃中，对照组全天活菌比例呈先升高后降低的变化规律，于晨饲后11 h（20:00）出现峰值；而试验组均无周期性变化规律；与对照组相比，试验组在08:00、11:00、05:00时和全天平均活菌比例升高（P＜0.05），而在20:00时，植物乳杆菌组活菌比例有降低趋势，乳酸菌复合系组活菌比例则显著降低（P＜0.05）。在十二指肠中，对照组全天活菌比例无明显周期性变化，也在20:00时出现峰值；试验组全天活菌比例无明显变化规律；与对照组相比，乳酸菌复合系组活菌比例在17:00升高（P＜0.05），而植物乳杆菌组活菌比例在20:00时显著降低（P＜0.05），植物乳杆菌组出现峰值的时间推后到02:00时。

表2 投喂外源乳酸菌对奶牛瘤胃与十二指肠中活菌比例的影响 %

2.2 投喂外源乳酸菌对奶牛胃肠道VFA浓度的影响 因瘤胃及肠道中异丁酸、戊酸以及异戊酸的含量很低，故本试验中总挥发性脂肪酸（TVFA）含量只计算乙酸、丙酸和丁酸含量。奶牛胃肠道VFA浓度变化如表3所示，在瘤胃中，与对照组相比，试验组乙酸、丁酸和TVFA浓度降低（P＜0.05），植物乳杆菌组丙酸浓度也显著降低（P＜0.05），乳酸菌复合系组丙酸浓度无显著变化（P＞0.05）；在十二指肠中，与对照组相比，仅乳酸菌复合系组的乙酸和TVFA浓度升高（P＜0.05），丙酸和丁酸在各组间差异不显著（P＞0.05）；直肠中，各组VFA和TVFA浓度差异均不显著（P＞0.05）。

表3 投喂外源乳酸菌对奶牛胃肠道VFA浓度的影响

由图2可知，在瘤胃中，各组TVFA变化规律基本一致，均在晨饲（09:00）后2～5 h逐渐升高，之后逐渐下降，采食后11 h（20:00）达最低值，与对照组活菌比例出现峰值的时间一致；在第2次采食（21:00）后也呈相似的周期性变化规律。在十二指肠中，对照组TVFA浓度在20:00达到最低值；乳酸菌复合系组TVFA浓度高于对照组，但未表现出明显的周期性变化规律；植物乳杆菌组既没有提高TVFA浓度，也未表现出周期性变化。在直肠中，对照组全天TVFA浓度也呈先升高后降低的变化趋势，在17:00出现峰值；植物乳杆菌组在14:00出现峰值，乳酸菌复合系组变化比较平缓。

图2 奶牛胃肠道TVFA昼夜变化规律

3 讨 论

3.1 投喂外源乳酸菌对奶牛瘤胃和肠道活菌比例的影响本试验中，添加植物乳杆菌和乳酸菌复合系均可显著提高瘤胃中活菌比例，但未显著提高十二指肠中活菌比例，这与Xu等[15]和符运勤[16]报道一致，即饲粮中添加外源益生菌活菌制剂可以提高瘤胃细菌的数量，但未改变粪便菌群丰度和多样性。本试验投喂的外源乳酸菌也增加了瘤胃中活菌的比例，但对肠道细菌影响不明显。可能外源乳酸菌本身活菌比例较高，通过优化瘤胃内主导菌群的活性，对瘤胃内环境起到积极作用[17]。而乳酸菌在到达十二指肠时，需要通过真胃，其分泌的胃酸、溶菌酶等能够裂解和杀灭细菌，致使到达肠道的活菌比例不足。大量体外试验证明[18-21]，益生菌在发挥益生作用时，需要突破胃酸和胆碱的屏障才能有足够数量的活菌到达肠道。由此可见，筛选开发出具有较高耐受性，且与动物品种及生长阶段高度匹配的优良菌株及其制剂，才能发挥益生菌应有的功效。

3.2 投喂外源乳酸菌对瘤胃和肠道VFA浓度的影响 本试验中，添加植物乳杆菌和乳酸菌复合系均显著降低了瘤胃中VFA浓度，可能是瘤胃中产生的VFA被添加的乳酸菌利用而产生乳酸[22]，而乳酸则进一步被其他细菌利用，其具体原因有待进一步研究。

在十二指肠中，仅乳酸菌复合系组提高了乙酸和TVFA浓度，这与Giang等[23]报道一致，在生长猪饲粮中添加益生菌可以增加肠道乳酸、乙酸含量，对丙酸和丁酸没有影响。其原因可能与添加的乳酸菌种类有关，一般同型乳酸菌发酵后只产生乳酸，异型乳酸菌发酵后除产生乳酸外，还能产生微量乙酸、乙醇及其他短链脂肪酸。本试验中，植物乳杆菌属于同型乳酸菌，发酵后不会提升乙酸等其他有机酸浓度；而乳酸菌复合系成分较多，发酵产生的代谢产物较多。在直肠中，添加2种外源乳酸菌对VFA浓度无显著影响，这与于卓腾等[24]研究结果一致，将鸡肠道分离出的乳酸菌研制成复合乳酸菌，从饮水中饲喂给肉仔鸡，肉仔鸡盲肠中VFA浓度升高，但在饲养后期各组VFA浓度无显著差异。这可能缘于动物不同生长阶段对乳酸菌的利用有差异。

由上说明，投喂外源植物乳杆菌和乳酸菌复合系对瘤胃、十二指肠和直肠VFA浓度的影响依次减弱。其原因可能是细菌在不同部位发挥的作用不同，瘤胃中的优势菌群为一些纤维素降解菌，在肠道中则转化为可利用糖类的微生物[25]。

3.3 投喂外源乳酸菌的不同效果研究 在瘤胃中，乳酸菌复合系组的乙酸、丙酸和TVFA浓度显著高于植物乳杆菌组；在十二指肠中，乳酸菌复合系组的活菌比例显著高于植物乳杆菌组，且添加乳酸菌复合系可以显著提高十二指肠中乙酸和TVFA浓度，说明投喂外源乳酸菌复合系优于单菌植物乳杆菌。这与董晓丽[26]的研究结果一致，即饲喂植物乳杆菌对哺乳期犊牛瘤胃中乙酸和TVFA浓度有降低趋势，添加植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌的复合益生菌后TVFA浓度有升高趋势。原因可能是本试验乳酸菌复合系制剂中含有芽孢杆菌，而芽孢杆菌对抗胃肠道环境的耐受性强于单纯的乳酸菌制剂[27-28]。Rolfe等[29]认为，复合菌效果优于单一菌，因为前者能更好地促进乳酸菌增殖，进而发挥益生功能，且益生菌之间存在组合效应[16,30]。

3.4 胃肠道活菌及VFA呈一定的变化规律 反刍动物瘤胃细菌呈一定的昼夜变化规律[31-32]。本试验中，对照组瘤胃活菌比例全天呈先升高后下降的周期性变化，于晨饲后11 h（20:00）出现峰值，这种波动反映了营养供给以及生理环境的变化。动物刚采食后，营养物质的大量供给引起细菌生长速度加快，到20:00时达到最高值，之后随营养物质的消耗和瘤胃细菌的不断发酵，瘤胃内pH、渗透压、温度等指标改变，最终引起细菌浓度下降。瘤胃中VFA浓度也呈一定的周期性变化[33]。本试验结果显示，瘤胃中各组VFA和TVFA浓度的变化规律一致，均在饲喂后2～5 h逐渐升高，之后逐渐下降，在采食后11 h（20:00）达最低值。这是因为动物采食后，饲料被相应微生物降解发酵，产生大量VFA；之后VFA被分解供能，其浓度逐渐降低，瘤胃中VFA保持着边产生、边吸收、边流通的动态平衡。在十二指肠中，对照组和乳酸菌复合系组全天活菌比例无明显周期性变化，但均在20:00出现峰值；对照组TVFA 浓度变化与瘤胃TVFA浓度变化规律一致，同样在20:00到达最低值。

4 结 论

本研究结果表明，投喂外源植物乳杆菌和乳酸菌复合系均可显著提高奶牛瘤胃中活菌比例，显著降低瘤胃中VFA和TVFA浓度，对肠道消化道微生物活菌比例及VFA浓度影响有限；乳酸菌复合系的效果优于植物乳杆菌；奶牛日饲喂2次，在采食后11 h可能是一个关键时间点，在该时间点瘤胃和十二指肠的活菌比例最高，而VFA浓度最低，说明此时瘤胃酸性环境减弱，有利于细菌存活，为生产中合理补充益生菌制剂的时间提供依据。