ESR1与PGR基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴的表达研究

田志龙，刘秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，王玉琴，张效生，张金龙，储明星*

（1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2. 河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受诸多因素影响。大多数绵羊属于季节性发情、单羔品种，且绵羊产羔性状的遗传力较低，仅为0.1左右，常规育种技术在短期内很难改良产羔性状。因此，如何较快提高绵羊产羔数是养羊业亟待解决的难题。雌激素受体和孕激素受体都属于类固醇核受体超家族[1]。绵羊雌激素受体α由 ESR1基因（Estrogen Receptor 1）编码，具有调控转录蛋白质的功能，通过与靶基因上的特异性效应元件相结合，从而调节靶基因的表达[2]。雌激素受体α与雌激素结合后，对胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生长发育都发挥着重要作用[3]。国内外许多研究证实ESR基因是调控猪高产仔数的主效基因之一[4]。Hewitt 等[5]研究表明，敲除ESR基因后将导致小鼠出现促黄体生成素（LH）调节紊乱、卵巢不排卵等现象。研究表明，ESR基因与小尾寒羊[6]和湖羊[7]多羔繁殖紧密相关。孕激素受体（Progesterone Receptor，PGR）属于甾体激素核受体家族的成员，是配体活化的转录因子，可与孕激素结合后发挥生理功能，在动物的发育、生殖、内环境稳态中起着十分重要的作用[8-9]。许多研究表明PGR信号传导是卵母细胞排卵所必须的[10]。Rowan等[11]发现，PGR缺失小鼠成年后大脑、子宫、卵巢均发生表型变化，并且无法排卵。综上可知，ESR和PGR基因在动物繁殖中存在重要的作用，但其在不同繁殖力小尾寒羊群体的表达研究并不多见。

绵羊FecB基因是学术界公认影响绵羊产羔数的主效基因[12]。在实际生产中发现在小尾寒羊群体中FecB基因野生型个体中存在产多羔的现象。使用Taqman探针法对小尾寒羊进行分型，选择FecB基因突变野生型小尾寒羊，连续观察黄体数并记录产羔数（产羔数和黄体数均大于或等于2，则定义为多羔）。本研究获得小尾寒羊FecB基因突变野生型单羔群体和多羔群体（下文简称单羔、多羔），采用反转录PCR结合实时荧光定量PCR技术检测ESR1和PGR基因在不同繁殖力小尾寒羊群体中的表达差异，期望从转录水平初步揭示ESR1和PGR基因在绵羊多羔繁殖中的作用，为深入研究绵羊多羔性状机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和主要试剂 小尾寒羊（FecB野生型单羔和多羔）来自天津市畜牧兽医研究所种羊场。挑选健康状况良好的成年母羊各3只，使用阴道孕酮栓（Controlled Internal Drug Release，CIDR）进行同期发情处理，12 d后撤栓。在撤栓后45 h屠宰并立即采集大脑、小脑、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏12种组织，液氮中保存，转移到-80℃冰箱保存备用。RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京），2×Taq PCR Master Mix购于北京拓英坊生物技术有限公司（北京），反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和荧光定量染料（SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ）均购于TaKaRa公司（大连）。

1.2 组织总RNA的提取和检测 采用动物组织总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，并用NanoDrop 2000检测提取RNA的纯度和浓度，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.3 引物设计 根据GenBank提供的绵羊ESR1和PGR基因mRNA序列（登录号分别为XM_012137956.2、XM_012169084.2），利用Primer Premier 6.0软件进行跨外显子引物设计，以GAPDH（NM_001190390.1）作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物名称和序列、退火温度以及扩增片段大小见表1。

1.4 cDNA合成 利用反转录试剂盒反转录合成cDNA:PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL， 总 RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O补足至总体积为20 μL。反转录反应条件：37℃15 min，85℃ 5 s，获得cDNA第1链。全程在冰上操作。反转录产物进行5倍稀释，用持家基因GAPDH进行PCR检测，将符合标准的cDNA置于-20℃保存，以用于检测目的基因的表达。

1.5 RT-PCR反应 PCR体系总体积为20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L 的上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 8 μL。反应程序：95℃ 预变性 5 min；95℃ 变 性 30 s，60℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸30 s，30个循环；72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

1.6 实时荧光定量 PCR 利用 Roche Light Cycler®480 Ⅱ型荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，反应体系总体积为 20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各 0.8 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL，cDNA 模 板 2 μL。PCR程 序：95℃ 预 变 性 5 s，95℃变性10 s，60℃ 30 s，40个循环；反应结束后对熔解曲线进行分析。以GAPDH基因为内参基因，每个样品重复检测3次。

1.7 统计分析 采用 2-△△Ct法[13]计算目的基因相对表达量，用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素ANOVA分析，使用LSD法进行多重比较，所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取与cDNA合成 提取不同繁殖力小尾寒羊各组织的总RNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。28 S和18 S条带清晰可见，且灰度值约为2:1，而5 S带几乎没有，说明提取的总RNA无明显降解。Nanodrop 2000检测各组织RNA，A260/A280均在1.8～2.1，表明提取的RNA纯度较高，可用于后续的荧光定量PCR反应。

表 1 绵羊ESR1和PGR基因的引物信息

2.2 绵羊ESR1、PGR基因组织表达谱 如图1所示，GAPDH基因在小尾寒羊不同组织表达扩增效果良好，具有明显内参基因特征。小尾寒羊多羔群体中ESR1基因在子宫、输卵管、卵巢、垂体中高度表达；在大脑、小脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织微弱表达。PGR基因在小尾寒羊多羔群体的输卵管、子宫、卵巢高表达，在其他组织微弱表达。小尾寒羊单羔群体中ESR1、PGR基因的表达模式与多羔群体类似。

图1 多羔小尾寒羊（A）和单羔小尾寒羊（B）各组织中ESR1和PGR基因的PCR产物凝胶电泳图

2.3 绵羊下丘脑-垂体-卵巢轴相关组织中ESR1和PGR基因的表达 如图2所示，ESR1基因在小尾寒羊子宫、输卵管的表达量最高，其次是在卵巢，在下丘脑、垂体的表达量最低。ESR1基因在多羔小尾寒羊子宫、卵巢、输卵管、垂体和下丘脑组织中的表达量与单羔小尾寒羊无显著差异（P＞0.05）。PGR基因在小尾寒羊输卵管、子宫的表达量最高，其次是卵巢，在下丘脑、垂体组织的表达量最低。PGR基因在多羔小尾寒羊输卵管、子宫、卵巢和下丘脑中的表达量均极显著高于单羔小尾寒羊（P＜0.01）；在垂体组织的表达量显著高于单羔小尾寒羊（P＜0.05）。

图 2 ESR1、PGR基因在不同群体小尾寒羊的组织表达

3 讨 论

3.1 ESR1基因表达对动物繁殖的影响 研究发现，雌激素受体与雌激素结合后，对胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生长发育发挥着重要作用[14]。本研究发现，ESR1基因在卵泡期不同繁殖力小尾寒羊群体的子宫、输卵管的表达量最高，其次是在卵巢，在下丘脑、垂体组织的表达量最低。丁威[15]发现，在猪早期阶段卵巢中雌激素受体主要在卵巢表皮细胞、卵母细胞巢中的卵原细胞和卵母细胞以及原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞的核中表达。白淑等[16]使用免疫组织和荧光定量技术检测济宁青山羊出生后发育过程中雌激素受体在子宫的定位及表达，结果发现雌激素受体1在子宫腔上皮、腺上皮、基质、血管内皮和平滑肌细胞的胞核中均有表达，证明了雌激素受体1参与调节子宫内膜与肌层的增殖和分化。刘欣[17]以成年母牛为研究对象，发现卵泡期ESR1和PGR在卵巢中表达量最高，其次是输卵管，子宫最低。Laws等[18]在小鼠中发现下丘脑-垂体-卵巢轴ESR1信号异常会导致卵巢上皮肿瘤的发生。ESR1过表达后，会对甲氧氯的敏感性增强，可能导致卵泡闭锁[19]。Winuthayanon等[20]研究证明，雌激素通过ESR1作用于子宫基质发挥其生理功能，之后通过ESR1作用于子宫上皮继续发挥功能，推测可能是其与雌激素作用诱导子宫细胞增殖分化[21]。Pawar等[22]研究证明，ESR1在雌性动物子宫基质细胞分化及子宫蜕膜化的过程中发挥着关键作用。Cerny等[23]通过转录组数据分析，认为雌激素和ESR1结合后调节输卵管相关基因的表达和生理作用。本研究中ESR1在子宫中的高表达量可能是由于埋植阴道栓刺激所致；ESR1基因在小尾寒羊单、多羔群体子宫、输卵管、卵巢的组织均有表达，暗示ESR1可能在小尾寒羊发情或者排卵的过程中起着重要作用，但具体机制有待继续研究。

3.2 PGR基因表达对动物繁殖的影响 研究发现，孕激素受体在动物机体的所有主要生理系统中低表达，但在中枢神经系统和雌性动物生殖道中高表达[24]。本研究通过荧光定量PCR检测了卵泡期小尾寒羊单羔和多羔群体下丘脑-垂体-性腺轴繁殖调控组织PGR基因的表达差异，结果发现PGR主要在输卵管、子宫、卵巢、垂体、下丘脑表达，这和啮齿动物、哺乳动物表达模式相似。如在猪的发情期和妊娠早期的子宫组织[25]以及在啮齿动物卵巢[10]、输卵管[26]组织均能检测到PGR基因的表达。PGR缺失小鼠成年后大脑、子宫、卵巢均发生表型变化，并且无法排卵[11]。本研究还发现，PGR在小尾寒羊多羔群体输卵管、子宫、卵巢、下丘脑的表达量极显著高于单羔群体；在多羔群体垂体中的表达量显著高于单羔群体。Chen等[27]的研究发现，PGR基因在高繁殖力的策勒黑羊群体的表达量高于低繁殖力的和田羊，这和本研究的结果一致，PGR基因存在多态位点可以影响小尾寒羊产羔数[28]。这些结果暗示PGR基因参与小尾寒羊多羔性状的调控。

4 结 论

本研究通过RT-PCR技术发现，ESR1和PGR基因在小尾寒羊单、多羔群体大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均有表达；荧光定量PCR分析发现ESR1、PGR基因分别在小尾寒羊子宫和输卵管组织中高表达；PGR基因在多羔群体下丘脑-垂体-卵巢轴组织中的表达量显著高于单羔群体，暗示PGR在小尾寒羊多羔性状的调节过程中起到一定作用。