miRNA和lncRNA调控动物毛囊发育的研究进展

王俊永，王天赐，王 丹，张 禹，王 昕

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

毛囊是皮肤的衍生物，因动物种类以及生长部位不同而导致其长度和形状有所差异，但其都有相似的基本结构。毛囊由连接组织鞘、内根鞘、外根鞘、毛球和毛干等构成，大部分哺乳动物的毛囊分为初级毛囊和次级毛囊。毛球内包围着一些密集的真皮纤维细胞，内陷形成毛乳头，是一个发送和接收信号诱导的结构[1]。围绕毛乳头的部分为毛母质，毛母质的角质细胞是体内生长最快的细胞，生长期毛母质细胞增殖分化产生毛干和内根鞘[2]。Dicer酶是miRNA形成过程中的一个关键酶，特异性敲除Dicer基因导致小鼠表皮中多种miRNA减少以及小鼠的毛发生长有缺陷[3]。另一项研究表明，miRNA的加工酶Drosha酶在小鼠的毛发生长以及表皮的内稳态方面有着重要的作用[4]。此外，在绒山羊次级毛囊发育中，lncRNA作用于Wnt信号通路从而影响毛囊生长发育[5]。越来越多的报道将miRNA、lncRNA与毛囊的生长发育紧密联系起来，而且毛囊的发育直接影响经济动物毛发的品质。因此，研究miRNA和lncRNA对毛囊发育的分子调节机理及提高绒毛的产量和品质具有重要意义。

1 miRNA与lncRNA简介

miRNA是一种仅有18～25个核苷酸的单链非编码RNA，广泛存在于各类生物体内。miRNA的形成由基因组转录、pri-miRNA到成熟的miRNA序列经历了一系列复杂的变化。miRNA的经典作用机制是成熟的miRNA与RNA诱导的基因沉默复合体形成miRISC，此复合物通过miRNA特异地识别特定基因的3'非翻译区，并与之完全互补或部分互补从而抑制或者沉默mRNA的表达。随着研究的深入，发现miRNA在转录后水平还可以作用于5'非翻译区、启动子区，甚至可能抑制复制和转录水平[6]。从第1个miRNA（lin-4）发现至今，随着高通量测序技术的高速发展，人们发现越来越多的miRNA在生物体内扮演着不可替代的作用，并且预测miRNA参与了动物全基因组中20%～30%基因的表达调控[7]。

LncRNA是长度大于200 nt的非编码RNA转录本，不同于miRNA较为单一的作用机制，lncRNA的作用机制多样，这与其复杂的二级和三级结构密切相关[8]；而且又根据其不同的亚细胞定位分为核lncRNA和质lncRNA，前者主要通过染色质修饰、转录激活、转录干扰等方式行使生物学功能，后者主要充当“诱饵分子”与蛋白质、DNA和RNA相互作用[9]。

2 miRNA在毛囊发育中的作用

2.1 miRNA在毛囊发育中的时空表达 毛囊的发育分为生长期、退行期和休止期3个阶段。毛囊的形成以及周期性发育是一个分子调控过程，研究miRNA在毛囊发育不同时期的表达有着重要意义。Wang等[10]在绒山羊羊绒生长期和休止期共检测到541个miRNA，其中有15个在生长期表达上调，8个下调；Liu等[11]对绒山羊胎儿发育过程中皮肤毛囊发育的3个重要时期（妊娠45、55、65 d）的样本进行了高通量测序，发现oar-miR-377-3p、oar-let-7和oar-miR-200家族中的oarlet-7b/d/f和oar-miR-200b/c在55日龄和65日龄胎儿的表达量比45日龄胎儿上调，而oar-miR-106a和oarmiR-218a则明显下调；Zhang等[12]鉴定了鸭子皮肤中的 miRNA，其中 miR-107、miR-10a、miR-17-3p、miR-31、miR-451、miR-2188以及miR-1623可能调控Wnt/β-catenin、Shh/BMP和Notch信号通路中的相关基因；赫晓燕等[13]制备了羊驼皮肤的miRNA芯片与Affymetrix多物种miRNA芯片跨物种杂交，并对耳部和背部皮肤的miRNA 进行筛选，结果显示在其耳部和背部皮肤中高表达差异2倍以上的miRNA有39个，对let-7b和miR-24在2个部位的q-PCR检测结果与基因芯片结果一致，并预测它们的靶基因与毛囊生长发育和毛发品质相关；Gao等[14]检测到包括miR-143、miR-10a和let-7在内的14个调控湖羊毛囊发育的miRNA，其中 miR-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961和NW_004080190.1_13733在湖羊的大波纹皮和小波纹皮中差异表达；Liu等[15]在藏绵羊毛囊中检测到244个高表达的miRNA，其中有204个miRNA在哺乳动物中高度保守，进一步的分析确定了6个特异表达的miRNA可能作用于Wnt信号通路中的关键基因；Bai等[16]检测了6个miRNA表达量在辽宁绒山羊毛囊生长期相对高于退行期和休止期，而另外7个miRNA则在退行期和休止期表达上调；Wen等[17]筛选了159个在成年山羊和绵羊皮肤及耳缘组织中表达的miRNA，其中105个高度保守，而且let-7、miR-17、miR-30、miR-15和miR-8家族的表达频率很高。通过以上研究可见，miRNA在不同动物的皮肤中都有分布并表达，而且在毛囊发育的不同阶段，miRNA的表达水平也存在差异，这说明在毛囊发育过程中相关的miRNA参与了调控。同时，miRNA表达的时空特异性也更加彰显了其在毛囊生长发育中的重要地位。

2.2 miRNA调控毛囊生长发育的研究进展 毛囊周期性发育是多基因参与、紧密联系且相互制约的复杂生理生化过程，miRNA可以通过靶向不同的信号通路和转录因子，从而对毛囊不同发育阶段的调控发挥作用[18]。

2.2.1 miRNA对毛乳头细胞的影响 毛乳头细胞是位于毛囊基底层的信号枢纽，在毛干的形成、维持毛囊的形态发生、调控毛囊周期以及毛囊的再生方面起着重要的作用。随着毛乳头细胞培养代数的增加，逐渐失去多层聚集能力；代数低的毛乳头细胞能够诱导裸鼠背部长出毛发，而代数高的毛乳头细胞不能；以miRBase 18.0为依据，通过miRNA芯片检测到1 924个miRNA，低代数的毛乳头细胞相对于高代数毛乳头细胞显著上调的有27个miRNA，下调的有106个。通过建立miRNA 和Wnt通路的网络图发现，miR-195-5p在mRNA水平上抑制LRP6的表达，从而调控毛乳头细胞Wnt/β-catenin通路的活化[19]。Zhou等[20]研究发现，miR-125b在绒山羊皮肤毛发周期的3个阶段表达量不同，基于毛乳头细胞构建的miR-125b的过表达模型和抑制表达模型证实了miR-125b 影 响 FGF5、IGF-1、SHH、TNF-α、MSX2、LEF-1、FGF7、NOGGIN、BMP2、BMP4、TGF-β1 和β-catenin的表达，双荧光素酶实验验证了miR-125b与FGF5和TNF-α之间有着直接的作用。FGF5本身是一种生长因子，主要调控毛发的长度[21]；而TNF-α可能影响毛发的生长速度[22]。综上表明，miRNA通过抑制与毛囊再生相关的基因及相关信号通路的关键分子而调控毛囊周期以及毛囊的再生能力。

2.2.2 miRNA对表皮角化细胞的影响 皮肤表皮由角化细胞和非角化细胞构成，其中毛是表皮角化的产物，主要由角化细胞紧紧排列而成。因此，研究miRNA对角化细胞增殖分化的影响对毛囊发育有着重要的作用。胰岛素样生长因子家族中的IGF-1R广泛分布于毛囊中，通过与IGF结合，可以将信号传导刺激毛囊细胞的增殖，而缺失IGF-1R基因的小鼠表皮变薄，角质细胞显著减少[23]。miR-let7a在绒山羊生长期中的表达较退行期弱，而其靶基因IGF-1R在绒山羊生长期中的表达较退行期高[24]，表明miR-let7a对IGF-1R具有调节作用。Yuan等[25]研究发现，miR-22表达量在小鼠毛囊退行期上升而在休止期达到最高；体内研究表明，过表达miR-22促进了毛发周期由生长期向退行期的过渡，对应的miR-22缺失体则延迟了进入休止期的时间，并且加速了毛囊由休止期向生长期的转变，而过表达的miR-22通过抑制角化细胞的生长和分化同时加速细胞凋亡过程；并证实了miR-22直接抑制了多个与毛囊生长分化相关的基因，包括Dlx3、Foxn1和Hoxc13等。miR-31突变体小鼠的表皮角质细胞功能损伤，导致毛囊细胞异常的增殖、凋亡和变异；相反，在miR-31的缺失体中毛发生长得到了促进，而miR-31靶向作用于LATS2，LATS2则可以调控角质细胞的生长[26]。Ahmed等[27]研究表明，miR-214在小鼠皮肤的表皮表现出不同的表达模式，通过在角质细胞中的过表达来抑制其增殖，导致小鼠毛囊发育受阻、毛球数量减少以及毛发变细等现象。β-catenin蛋白作为Wnt信号通路中的一个关键信号开关，广泛地参与到动物毛囊的发育中[28]。而miR-214对毛囊发育的抑制作用主要是通过靶向调控β-catenin从而影响Wnt信号通路来实现的。

2.2.3 miRNA对毛囊干细胞的影响 毛发的形成以及之后的再生需要一个持续的干细胞群来维持这一过程，而毛囊干细胞的表达有4个关键的调控因子，即Sox9、Tcf-3、LHx2和NFATc1[29]。已有的研究表明，TCF-3是miR-24的靶基因。 miR-24过表达使毛发变细以及改变毛发的结构，而且改变了毛发角质形成细胞的正常分化过程[30]。过表达miR-22也会损害毛囊干细胞群的形成能力[25]。Wang等[31]研究发现，miR-205的缺失会造成新生小鼠致死以及表皮、毛囊生长严重受损的现象；在毛囊发育中，加速新生小鼠皮肤干细胞转化沉默。因此，miRNA对毛囊干细胞的干性维持及正常的毛囊周期发育具有重要作用。

2.3 miRNA与信号通路 Wnt信号通路是众多参与毛囊周期发育信号的重要通路之一，经典的Wnt/β-catenin信号通路参与了皮肤的生物学过程，具有调控上皮的形态发生、毛囊发育以及相关细胞分化的作用[32]。miR-31在小鼠的生长期上调并且在退行期和休止期下调，而miR-31缺失导致毛囊生长期加速发育并且改变了毛基质细胞的分化和毛干的形成。研究表明，miR-31负调节FGF10，而FGF10是Wnt通路和BMP通路的一个信号分子[33]。李珊珊等[34]研究发现，miR-1623在麒麟鸡皮肤中高度表达， Wnt信号通路中Wnt4基因的3'UTR存在miR-1623的结合位点（TGCCTG）；q-PCR以及双荧光素酶实验发现，相对于怀乡鸡，麒麟鸡皮肤中的miR-1623表达水平显著升高，而Wnt4 mRNA的表达水平显著降低，因此miR-1623靶向负调控Wnt4。唐晓慧等[35]的研究结果表明，miR-184在皮肤中表达最强，并且在毛囊生长期到退行期的表达量有上升趋势；miR-205在多个组织中均有表达，且皮肤、肺、肾脏、小肠、直肠、瘤胃、肌肉中的表达量较高，而miR-205则表现出先升后降，在退行期的表达量最高，两者的候选靶基因则可能通过Wnt信号通路调控毛囊的生长周期。

TGF-β信号通路具有调控细胞的生长、分化、凋亡、迁移及细胞外基质的形成等多种重要的功能，而miR-1298-5p则通过抑制TGF-βR1间接的调控TGF-β信号通路，进而影响毛囊的正常发育[36]。在新生小鼠皮肤中，miR-205则通过负调节pi3k信号通路来保证皮肤干细胞的正常增殖[32]。由此可见，miRNA主要通过调控相关信号通路的信号分子从而影响毛囊的周期发育。

2.4 miRNA影响动物毛色的相关进展 毛色也是毛用动物重要的经济性状之一，哺乳动物的毛色主要由被毛发育和黑色素种类及数量共同决定。朱芷葳等[37]检测出20个在成年羊驼皮肤组织中高表达的miRNA，其中miR-25对色素形成关键基因Mitf具有调控作用，表明miR-25可能参与到羊驼毛发颜色的调控过程。

贾小云等[38]检测了miR-663在羊驼皮肤中的表达量，并从mRNA和蛋白水平上证明miR-663能够靶向抑制TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad 和 Wnt信号通路，进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素合成。Wu等[39]通过对不同颜色山羊（白色和黑色）毛囊样本的测序，检测到6个异常表达的miRNA，其中miR-10b通过影响DVL3来调控Notch信号通路，且miR-211的表达模式与miR-10b相类似，而包括Notch和MAPK等的多个信号通路都可能调节羊毛颜色的形成，这表明miRNA在调控羊毛颜色形成上有着重要的作用。Qu等[40]研究表明，miR-202在黑色小鼠皮肤中的表达高于白色小鼠中，而且wnt5a、kit和tcf7在黑色小鼠体内的表达与miR-202负相关，说明miR-202在白色小鼠和黑色小鼠中有着不同的表达方式，即可能调控小鼠毛色的形成。

3 LncRNA在毛囊发育中的作用

LncRNA的作用机制多种多样，但目前发现的影响毛囊发育的大部分lncRNA仍集中在通过调控相关的信号通路以及调控相关基因的甲基化等来实现。

3.1 毛囊生长发育相关的lncRNA的鉴定 Wang等[10]通过高通量测序鉴定了绒山羊毛囊发育的生长期和休止期的1 108个lncRNA，与休止期相比，其中有41个lncRNA表达量在生长期上调，157个lncRNA表达量下调；同时检测了lncRNA对其靶基因cis和trans的影响，推测这些lncRNA在毛囊发育和毛囊周期调控中具有一定的功能。郭杨等[41]对羊绒生长期和休止期显著差异表达lncRNA进行了筛选及qRT-PCR验证，并对其中的5个lncRNA（lncRNA9686、lncRNA14672、lncRNA19457、lncRNA15479和lncRNA13025）构建了过表达载体，为进一步研究lncRNA的功能和探讨特异性lncRNA在羊绒生长中的作用机制奠定了基础。Yue等[42]研究分析了大量lncRNA以及编码RNA在毛囊形成过程中的作用，其中只有Wnt2、FGF20在Wnt、Shh、Notch和BMP信号通路中差异显著，而lncRNA表达谱的分析共检测到15个显著差异表达的lncRNA，其中6个上调，9个下调。这些关键的差异表达基因和lncRNA可能调节毛囊发育的起始分子机制。毛囊的起始阶段是毛囊形成的第一个也是最重要的阶段。Zhu等[43]分离了来自辽宁绒山羊次级毛囊的lncRNA-H19转录物，其中生长期lncRNA-H19转录本的相对表达量显著高于休止期和退行期，表明lncRNA-H19转录本可能在山羊绒纤维的形成和生长中起重要作用。甲基化分析表明，H19基因启动子区的甲基化可能参与了辽宁绒山羊次级毛囊的转录抑制。

3.2 LncRNA调控毛囊生长发育的研究进展 刘阳[19]研究发现，lncRNA与Wnt通路中的mRNA存在3种关系：一是两者呈正相关（约占79%），二是两者呈负相关，三是mRNA不随lncRNA的上调或下调而出现差异表达现象。而在上调的基因中，H19有5个转录 本（ENST00000442037、uc001lva.4、uc021qbz.1、ENST00000439725和 ENST00000417089）， 它 们 是位于11号染色体上的lncRNA，microarray 显示上调倍数在56～12倍，而相关研究显示 H19能够促进Wnt/β-catenin 信号通路的激活[44]；差异表达的WIF1的mRNA下调了25.036 993倍，而WIF1是Wnt/β-catenin信号通路的关键抑制因子，因而猜测毛乳头细胞中的lncRNA通过促进WIF1的甲基化来激活Wnt/β-catenin通路。Lin等[45]通过lncRNA微阵列发现，相较于第10代毛乳头细胞，第4代毛乳头细胞中有1 683个lncRNA上调以及1 773个下调，其中RP11-766N7.3、H19和HOTAIR这3个lncRNA在毛乳头细胞以及Wnt信号通路中表达量异常，这可能为早期分化毛乳头细胞的毛囊诱导分化机制提供了新的研究方向。刘善博等[46]对细毛羊毛囊形态发生前期及基板期皮肤组织进行 RNA-seq， 通 过 CNCI、PhyloCSF、Pfam 对 测 序数据进行预测，共获得 884 个新的 lncRNA，其中13个lncRNA 存在潜在 cis 或 trans 靶基因，通过 GO、KEGG 富集分析，将 13 个差异 lncRNA 的靶基因显著富集到 NOD 样受体信号通路、利什曼病信号通路和NF-kappa B 信号通路中，说明这些差异表达的 lncRNA可能通过信号通路参与细毛羊毛囊形态发生过程。此外，基于荧光素酶报告基因系统的靶向关系表明，oarmiRNA-3955-5p 与 lncRNA005698 之间具有靶向关系，说明lncRNA005698 可能在细毛羊毛囊形态发生过程中起着重要作用，并且可能通过调节 oar-miRNA-3955-5p来调节细毛羊毛囊形态发生。lncRNA的作用方式多样，既可以通过Cis或Trans方式作用于靶基因，也可以作为内源性竞争RNA（ceRNA）竞争性的结合在靶基因上。由于lncRNA在调控毛囊发育的研究上目前仍处于起步阶段，因此对于lncRNA在毛囊发育中的重要作用及具体的机制仍需要深入研究。

4 存在问题及展望

miRNA主要通过作用于特定基因的3´非翻译区从而抑制或沉默基因的表达，其在毛囊的生长发育中的重要作用已经有很多报道，但目前关于miRNA参与毛囊发育的研究主要集中在miRNA的筛选及靶基因的鉴定方面，在动物体内的功能研究，尤其是家畜上的研究更为有限。因此，未来应该在体内和体外水平上对miRNA的调控机制进行深入研究，为家畜育种工作提供理论基础。

lncRNA虽然不具有编码能力，但其与细胞周期和分化、发育及多种人类疾病密切相关，能够在转录水平、转录后和表观遗传调控等多个层面上调控基因的表达水平。在毛囊发育领域，lncRNA的研究主要集中在筛选和鉴定影响毛囊发育的lncRNA，而对其调控机制尚不清晰，因此lncRNA的研究对揭示动物毛发生长的分子调控机制具有重要的意义。