禽类脂肪细胞分化调控的研究进展

王文浩，丁 芳

（1. 宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000；2. 苏州系统医学研究所，江苏苏州 215000）

目前依赖于表型值的选择在肉禽育种方面已经取得了显著进展，现代肉禽在产肉量和日增重等方面都有了明显的改善[1-2]，但同时也引发体脂大量沉积、机体代谢紊乱、免疫力下降、死亡率增高等问题[3]。其中，体脂沉积过多严重影响了肉禽的肉质和产肉量，增加肉品加工难度，给生产者和消费者带来巨大的损失。因此，控制肉禽体内脂肪过度沉积已经成为家禽育种的一个主要目标[4-5]。

动物体内脂肪的形成包括脂肪细胞增殖（数目增加）和肥大（体积增大），脂肪细胞的过度增殖和分化往往会造成脂肪生成过量，从而引发机体脂肪过度沉积[2]。目前研究人员已陆续建立多个物种前脂肪细胞原代培养模型，并且针对脂肪细胞增殖和分化调控做了广泛而细致的研究[6-7]。然而，禽类的脂肪分化研究相对落后，深入了解禽类脂肪分化的调控机理，有利于降低禽类腹脂沉积，为人类提供更加健康的畜禽产品，同时也能为动物遗传育种与品种改良技术提供参考。本文主要综述了禽类前脂肪细胞的分离培养、诱导分化方式及其分子调控网络的研究进展，为深入了解禽类脂肪分化机制提供科学指导。

1 禽类前脂肪细胞的分离、体外培养与鉴定

前脂肪细胞的分离一般采用胶原酶消化的方式，无菌条件下获得白色脂肪组织，经过胶原酶消化、过滤、离心即可获得基质血管部分，其中包含少量前脂肪细胞。刚接种的前脂肪细胞成分复杂，含有大量的血细胞以及少部分成熟脂肪细胞、巨噬细胞等，这些都可以经换液或者传代后去除，前脂肪细胞会变得更纯、更均一。也可以采用天花板培养法，将剪碎的脂肪组织小块贴在培养瓶顶部，经过1～2周，脂肪组织周围会慢慢长出未分化的前脂肪细胞，即去分化，该方法广泛用于研究脂肪细胞去分化过程。有研究表明，天花板培养法虽然能分离获得新的前脂肪细胞，但是该方法会抑制3T3L1前脂肪细胞成脂分化的能力，导致细胞内脂肪沉积降低[8]。因此，目前最常用的分离原代前脂肪细胞的方法是胶原酶消化法，在37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养。有研究发现，39℃条件下，猪前脂肪细胞增殖能力更佳，37℃培养环境会抑制猪原代前脂肪细胞的增殖与分化能力[9]。禽类前脂肪细胞的体外分离培养比较晚。20世纪80年代，Cryer等[10]首次分离获得了鸡原代前脂肪细胞。利用这个模型，研究人员开始探索鸡前脂肪细胞生长特性。2012年，He等[11]首次分离出鸭前脂肪细胞，检测了脂肪酸结合蛋白（Fatty Acid Synthase，FABP4）对脂肪分化相关基因表达的影响。随后本课题组分离出北京鸭原代前脂肪细胞，并且围绕细胞生长特性与诱导分化方式进行了系统的阐述[12]。前脂肪细胞的鉴定标准：第一，细胞能贴壁生长，形态为小三角形或梭形；第二，在特定的诱导条件下，梭形的前脂肪细胞可分化为圆形的脂肪细胞，细胞内沉积脂滴，并且能被油红O染色变成红色；第三，前脂肪细胞能特异性表达脂肪分化相关的某些标志基因，如FABP4等[11,13]。

与传统的细胞系相比，体外分离的原代前脂肪细胞往往能更真实地反映体内环境，并且可以根据实验需要，从不同部位、不同年龄的个体中分离出原代细胞开展实验，因而研究更具有针对性和真实性。尽管如此，原代前脂肪细胞存在着明显的缺点：第一，鸭脂肪组织中前脂肪细胞数量少，每次实验需要牺牲多只动物才能获得足够多的前脂肪细胞；第二，虽然年龄较大的动物体内脂肪组织沉积更多，但是幼禽的脂肪细胞增殖能力较好，因此，一般选择出生后1～2周的鸭作为实验动物；第三，前脂肪细胞在体外培养的时间不宜过长，多次传代会导致细胞生长变缓，诱导分化能力降低，因此一般用传代4次以内的细胞进行实验，以获得较真实可靠的结果[13]。

2 禽类前脂肪细胞的诱导分化方式

20世纪以来，研究人员利用体外培养的前脂肪细胞或者细胞系，围绕前脂肪细胞的诱导分化做了很多深入的研究。不同物种的前脂肪细胞的诱导分化方式不尽相同，对大多数物种而言，只需要加入诱导剂胰岛素、地塞米松（DEX）和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），即经典的“激素鸡尾酒”，前脂肪细胞就能分化为成熟的脂肪细胞。少数物种的前脂肪细胞分化需要同时添加一定量的罗格列酮或曲格列酮，刺激细胞成脂分化[14]。禽类前脂肪细胞体外分化的研究起步较晚，其诱导方法一直在探索中。早期研究发现，仅仅依靠经典的“激素鸡尾酒”，禽类前脂肪细胞并不能诱导分化，细胞内无脂滴沉积，而添加油酸后，胞内沉积较多脂滴，细胞能分化成熟[15]。其后Matsubara等[16]研究发现，仅添加脂肪酸混合物、转铁蛋白、胰岛素和白蛋白就能诱导鸡原代前脂肪细胞分化，说明外源脂肪酸是影响鸡前脂肪细胞分化的关键因素。Shang等[17]进一步报道单独添加油酸处理组，无论是否同时添加DEX都能很好地促进胞内脂滴的形成，细胞最终分化为成熟的脂肪细胞，证实油酸是鸡前脂肪细胞诱导分化的关键诱导剂。本课题组早期围绕鸭前脂肪细胞的诱导分化做了很多摸索实验，发现同时添加激素鸡尾酒和油酸，鸭前脂肪细胞能成功分化，而单独添加油酸的情况下，细胞内也能沉积脂滴，脂肪分化相关基因表达上调[11-12]。以上2种诱导方式调控鸭前脂肪细胞分化的具体机制，目前还不清楚。

胰岛素和DEX是大多数物种前脂肪细胞诱导剂主要成分，但是二者对鸡前脂肪细胞分化没有明显影响，都不能促进脂肪沉积[17]，本课题组前期围绕鸭前脂肪细胞开展的实验结果也充分说明了这一点[13]。罗格列酮被证实能促进前脂肪细胞诱导分化。本课题的研究发现，罗格列酮能通过促进脂肪合成与脂解，最终促进鸭前脂肪细胞分化成熟[18]。鸡前脂肪细胞诱导分化时，添加“激素鸡尾酒”与一定量的罗格列酮或曲格列酮，细胞脂肪生成增多，且脂解水平更强，进一步证实罗格列酮能促进禽类脂肪细胞分化。值得注意的是，单独添加油酸虽然能诱导鸡前脂肪细胞分化，但是其细胞脂解能力很弱，而正常的脂解能力是成熟脂肪细胞的表现之一。以上研究结果表明“激素鸡尾酒 ”与罗格列酮组合法是一种更有效的诱导方式，有利于禽类前脂肪细胞诱导分化为正常功能的脂肪细胞[19]。

禽类脂肪细胞分化的诱导方式不同于哺乳动物，原因可能与不同物种脂肪从头合成的发生部位不同有关。脂肪从头合成是指脂肪相关组织（肝脏和脂肪组织）利用非脂肪前体物（如糖代谢产生的碳水化合物），并进一步酯化为脂肪的过程。众所周知，啮齿类动物脂肪从头合成主要在肝和脂肪组织[20]，猪牛羊等动物主要在脂肪组织合成脂肪[21]，而禽类的脂肪从头合成主要发生在肝脏，然后通过脂蛋白运输到肝外，促使脂肪沉积在脂肪组织中[22]。禽类脂肪组织本身合成脂肪的能力低下，因此，体外分离出来的前脂肪细胞需要添加外源脂肪酸才能开启分化的过程。值得一提的是，有研究表明，油酸也能诱导鼠3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞，但是分化出来的细胞胰岛素敏感有一定的损坏，而经“激素鸡尾酒”正常诱导出来的脂肪细胞并未出现此现象[23]。油酸诱导禽类前脂肪细胞分化，是否也会损坏脂肪细胞胰岛素敏感，这一点还有待证实。

3 禽类前脂肪细胞的分子调控

脂肪细胞的分化是一个复杂的分子调控过程，研究已发现并证实了多个转录因子能参与脂肪分化的调控[24]。其中最关键的转录调控因子包括过氧化物酶体增殖物激活受体家族（Peroxisome Proliferator-activated Receptors，PPARs）、CAAT增强子结合蛋白家 族（CCAAT/enhancer Binding Protein，C/EBPs）、固醇调节元件结合蛋白家族（Sterol Response Elementbinding Protein，SREBPs）等。这些转录因子在脂肪细胞分化过程中，通过影响靶基因表达量或者活性的变化，从而实现对脂肪细胞分化的调控作用[25]。

3.1 PPARγ PPARγ属于PPARs家族，该家族包括α、β（δ）和γ 3个成员，通过与靶基因启动子上游的过氧化物增殖体反应元件结合，发挥其转录调控作用。PPARγ主要在脂肪组织中表达，参与调控脂质代谢和脂肪分化。在脂肪细胞分化调控网络中，PPARγ在脂肪细胞分化早期起关键作用，它先于大多数脂肪细胞特异性基因的表达[26]。研究证实，没有任何一个因子能在缺失PPARγ的情况下开启脂肪细胞的诱导分化过程，而且大部分脂肪分化因子都是通过激活PPARγ来发挥作用[27]。缺失C/EBPα基因的小鼠成纤维细胞，异位表达PPARγ后细胞能进行脂肪分化，而反过来却不能分化。目前，缺失C/EBPα后，C/EBP家族其他成员是否能部分补偿C/EBPα的功能以促进脂肪分化[28]，尚不清楚。

鸡PPARγ含有5个剪切体，其开放阅读框编码PPARγ1和PPARγ2 2个PPARγ异构体。PPARγ1在鸡腹部皮下脂肪组织中高度表达，并且在2～7周龄肥胖型鸡脂肪组织表达显著高于瘦肉型鸡，说明它与鸡脂肪沉积密切相关[29-30]。细胞水平上，用油酸诱导鸡前脂肪细胞分化，PPARγ表达水平在分化后第9小时达到峰值，早于其他分化基因，推测该基因可能是调控鸡脂肪分化早期的一个重要基因[15]。此外，PPARγ还能抑制鸡前脂肪细胞增殖，使细胞出现生长抑制现象，从而促进前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，当干扰该基因表达时，鸡脂肪细胞增殖能力增强，分化能力减弱，固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding factor1，SREBP1)、FABP4、 脂 蛋 白 脂 肪 酶（Lipoprteinlipase，LPL）等基因表达量均下降[31]。

鸭有PPARγ1与PPARγ2 2个异构体，前者可能与过氧化物酶体增殖有关，后者可能主要调控脂质代谢。细胞水平上，PPARγ的表达量在鸭前脂肪细胞诱导后第3天达到峰值，早于C/EBPα和FABP4，推测鸭PPARγ在脂肪分化早期起作用[12]。个体水平上，雏鸭静脉注射PPARγ特异性siRNA，第21和第35天鸭腹部皮下脂肪沉积量显著降低，脂肪分化关键基因LPL和FABP4表达都明显降低，表明PPARγ对鸭脂肪沉积有重要的调控作用，是脂肪分化的一个关键转录因子[32]。

3.2 C/EBP家族 C/EBP家族包括多个成员，其中与脂肪分化关系密切的主要是C/EBPα、β与δ。C/EBPα的表达早于其他基因，是诱导脂肪分化必不可少的。鸡前脂肪细胞诱导分化后，C/EBPα在诱导后24 h表达量达到峰值，而C/EBPβ与C/EBPδ的表达稍晚，分别在诱导后第48、36小时达到峰值，说明C/EBPα对于开启前脂肪细胞分化具有重要作用[33]。研究证实，鸡C/EBPα启动子上存在SREBP1与C/EBPβ的结合位点，鸡胚成纤维细胞DF1细胞系过表达二者时，都会降低鸡C/EBPα转录活性[34]。与此相反的是，3T3-L1前脂肪细胞过表达SREBP1或C/EBPβ，都会促进C/EBPα基因的转录[35]。产生这种结果的原因可能是由于不同物种前脂肪细胞的遗传背景不同，该差异产生的具体分子机制还有待进一步研究。此外，研究报道 PPARγ启动子上存在多个C/EBPα和C/EBPβ结合位点，鸡胚成纤维细胞系过表达C/EBPα和C/EBPβ都能刺激PPARγ基因启动子活性[34]。早期研究发现， C/EBPα可以通过直接结合鸡PPARγ启动子上的结合位点，进而激活PPARγ的转录。这些结果表明鸡C/EBPα和C/EBPβ能通过直接结合PPARγ启动子，促进后者的活化[36]。过表达PPARγ能促进下游靶基因FAS启动子活性提高，但是对C/EBPα启动子活性无明显影响[34]。可见，鸡C/EBPα和C/EBPβ能调控PPARγ转录活性，促进下游靶基因表达，而反过来PPARγ对C/EBPα和C/EBPβ没有直接的调控作用。另外，有研究报道，鸡胚胎成纤维细胞异位表达C/EBPα或者PPARγ后，都能转分化为类脂肪细胞，具体表现为细胞内有脂滴沉积，细胞表达脂肪分化标志基因FABP4，说明C/EBPα和PPARγ这2个转录因子对开启禽类前脂肪细胞分化起关键作用[37]。

3.3 Krüppel样因子家族（Krüppel-like Factors，KLFs）KLFs通过结合到靶基因启动子CACCC/GC/GT区域，调控众多基因的表达，它们参与调控一系列细胞生物学过程，包括胚胎发育、脂肪分化、脂质代谢、胰岛素抵抗、心血管疾病等[38-39]。

KLF7是KLF家族中的一员，在调控哺乳动物脂质代谢方面发挥重要作用。研究发现，KLF7在鸡腹脂中的mRNA表达量与鸡腹脂含量显著相关，它在瘦肉型鸡腹脂中的表达量明显高于肥胖型鸡[40-41]。鸡前脂细胞过表达KFL7导致LPL、C/EBPα与FAS基因启动子活性降低，阻碍前脂肪细胞分化为脂肪细胞。干扰KLF7基因表达，导致FABP4、PPARγ、C/EBPα启动子显著增强[41]。 由此可见，KLF7是抑制鸡脂肪分化的一个基因。过表达与干扰KLF7基因表达的研究结果都证实，KLF7能直接影响C/EBPα的活性，由此推断KLF7可能是通过调控下游靶基因C/EBPα，进而影响鸡前脂肪细胞增殖与成脂分化过程。

KLF2也能调控脂肪分化。研究发现，KLF2在出生后1周鸡腹脂中的表达量最高，随后表达量降低，但是其表达量与不同品系鸡脂肪沉积无显著关联[42]。 KLF2在鸡前脂肪细胞分化过程中的表达呈现逐渐降低的模式，鸡前脂肪细胞过表达KLF2导致PPARγ、C/EBPα、FABP4基因表达都下降，最终抑制脂肪分化。由此可见，KLF2通过抑制转录因子PPARγ、C/EBPα的表达而抑制鸡脂肪细胞分化[42]。进一步研究发现，过表达KLF2对鸡PPARγ和C/EBPα启动子转录活性有着不同的影响，它能激活其中2个不同长度的PPARγ启动子活性，3个C/EBPα启动子活性，这说明KLF2对二者启动子活性的影响可能与研究者构建的启动子长度有关[43]。

KLF3在鸡脂肪组织中也高度表达，过表达KLF3导致鸡前脂肪细胞中C/EBPα、FABP4、FAS和LPL启动子活性都显著降低，但是PPARγ活性会增加，推测该基因可能通过影响C/EBPα转录活性，从而实现对鸡脂肪细胞分化的调控。对KLF3进行定点突变，发现PVDLT位点发生的ASP突变与KLF3活性显著相关[44]。KLF5在鸡脾脏中表达量最高，腹脂中表达量很低[45]。诱导鸡前脂肪细胞分化过程中，KLF5表达量先剧烈降低，分化12 h后出现大幅上升。诱导鸡前脂肪细胞分化过程中，其表达量呈现逐步上升的趋势[45]。目前，关于KLF家族在禽类脂肪分化中的具体作用机理都还不太清楚，有待进一步研究探讨。

3.4 其他基因 FABP4是脂肪细胞分化中期、晚期的标志基因，它能促进脂肪酸的转运扩散，参与调控脂肪的生成和溶解的生化循环，因而在脂肪酸运输与代谢中起重要作用。FABP4的表达受PPARγ调控，作为后者的靶基因之一，FABP4在细胞分化晚期表达量最高，FABP4能为甘油三酯的形成提供脂肪酸，从而促进脂肪细胞肥大，诱导脂肪形成。鸡前脂肪细胞诱导分化时，过表达FABP4导致细胞释放游离脂肪酸增加，促进脂解，同时脂肪沉积显著增加。进一步研究发现，过表达FABP4能引起PPARγ表达在分化不同阶段的表达量都增高，推断FABP4是通过影响PPARγ途径而调控鸡脂肪分化的[46]。但是相同条件下诱导鸡前脂肪细胞分化，当干扰FABP4表达后，细胞脂肪分化、脂解并没出现明显的变化 ，具体原因有待进一步探讨[46]。FABP4基因在鸭脂肪组织中高度表达，在其他组织中表达量很低[11]。细胞水平上，油酸能促进FABP4基因表达量大幅上升，用油酸诱导鸭前脂肪细胞分化时，干扰FABP4基因表达导致与脂肪分化相关基因表达量都出现明显的降低，如FAS、LPL和PPARγ等，导致细胞成脂分化受阻，说明FABP4对于鸭脂肪分化起重要的调控作用[11]。

脂肪酸运输蛋白1（Fatty Acid Transport Protein 1，FATP1）是脂肪性运输蛋白家族中的一员，能帮助长链游离脂肪酸进出细胞，通过调控脂肪酸酰化作用，从而影响细胞脂肪酸代谢与脂肪沉积[47-48]。鸡前脂肪细胞转染FATP1基因特异性siRNA后，一方面，PPARγ、C/EBPα和FAS等基因mRNA表达、蛋白表达量都出现显著降低，前脂肪细胞分化受阻；一方面，细胞凋亡因子Caspase3与Bax都被激活，产生细胞凋亡。以上结果表明，FATP1基因在鸡前脂肪细胞生长与诱导成脂分化过程中都有重要的作用[49]。

近年来的研究发现，长链非编码RNA能够调控脂肪分化，对代谢相关组织发育与功能起重要作用。Wang等[2]通过正向选择基因和差异表达基因集成法，筛查出了10个控制鸭脂肪沉积的差异基因，具体作用机理有待进一步验证。Zhang等[50]利用RNA测序方法，检测鸡腹部皮下脂肪组织分离的前脂肪细胞分化过程中长链非编码RNA和mRNA表达情况，发现K2簇的基因可能在鸡脂肪分化中起关键作用。同时该研究团队围绕鸡肌肉脂肪组织中的前脂肪细胞，也筛查出了一些与肌内脂肪细胞分化相关的长链非编码RNA，发现10个基因、9个长链非编码RNA与鸡肌内脂肪细胞分化密切相关。通过此方法，研究者发现了一些与肌内脂肪分化相关的经典信号途径，以及一些新的信号通路[51]。以上研究结果，为今后深入了解禽类不同部位脂肪分化提供了新的有力依据。

4 小 结

脂肪细胞分化是一个复杂的生物学过程，受众多转录因子的共同调控。禽类脂肪分化发展相对落后，但经过众多探索工作，目前已经发现并证实了一些关键转录因子、标志基因影响禽类脂肪分化的机理，但仍有一些问题需要进一步研究。近年来，利用最新的测序技术，研究人员筛查到了一些新的特异性microRNA、长链非编码RNA，并初步证实了它们也能参与脂肪分化调控。未来的研究可以考虑深入挖掘这些特异性RNA影响脂肪分化的作用机理，全面诠释脂肪分化的调控网络，为畜禽品质改良和动物遗传育种技术提供科学基础。