中国荷斯坦奶牛ITGB2基因多态性及其与乳房炎抗性和产奶性状的相关分析

杨宇泽，冯 涛， 路永强，郭江鹏，常 卓，赵春颖，程京媛

（1. 北京市畜牧总站，北京 100107；2. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097）

整合素β-2（Integrin Subunit Beta 2，ITGB2）基因，又称CD18基因，定位于牛1号染色体。ITGB2基因D128G突变可引起牛常染色体隐形遗传疾病——牛白细胞粘附综合征（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD），是近年来的研究热点[1]。ITGB2基因主要在白细胞表达，相对于非反刍动物，在反刍动物间保守性更高[2]。白细胞粘附缺陷（Leukocyte Adhesion Deficiency，LAD）主要表现为典型的白细胞粘附功能异常[3]，已在牛[1,4-5]、水牛[6]、狗[4,7-8]和人类[9-10]中发现该疾病，大部分LAD是由于ITGB2基因D128G突变引起，但也有由ITGB2基因其他突变引起的[4,7,9]。牛ITGB2基因表现出高度多态，除D128G外的其他突变是否与牛体细胞评分（Somatic Cell Score，SCS）和产奶性状（305 d产奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳蛋白和乳脂）有关目前还没有相关报道。

前期本团队在中国荷斯坦奶牛群体中高体细胞数（High Somatic Cell Count，SCC）母牛（SCC＞250×105/mL，n=25）与低SCC母牛（SCC＜5×105/mL，n=25）ITGB2基因序列比对研究时发现了2个SNP位点（389C＞T[rs108953545]和774C＞T[rs209411752]）（杨宇泽等，未发表），这两个SNP位点与中国荷斯坦奶牛乳房炎抗性及产奶性状是否有关值得进一步研究。因此，本文研究牛ITGB2基因2个突变位点389C＞T和774C＞T在中国荷斯坦奶牛群体中的多态性，并分析其与SCS和产奶性状的关系，以期找到与以上性状相关的分子标记，为提高奶牛乳房炎抗性和产奶性状提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 乳房炎评分和产奶性状数据收集 1 212头中国荷斯坦奶牛第1胎SCS和5个产奶性状（305 d产奶量、乳脂和乳脂率、乳蛋白和乳蛋白率）数据来自于北京市畜牧总站的DHI（Dairy Herd Improvement）数据库。

1.2 基因型分析 2016年通过尾静脉采集北京市郊区2个牛场共1 212头中国荷斯坦奶牛血样，利用DNA提取试剂盒（TIANamp Blood DNA Kit，北京）提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶检测和NanoDrop 1000测定DNA浓度后保存待用。

奶牛个体DNA样品SNP位点基因型测定使用ABI PRISM SNaPshot（Applied Biosystems，CA，USA）方法进行。首先用普通PCR体系分别扩增包含389和774位点在内的片段，389位点扩增（产物长度389 bp）引物为F：5'-GAATCTGAATAGGCGTCCTGC-3'和R：5'-GGAGTAGGAGAGGTCCATCAGG-3'，774位点扩增（产物长度376 bp）引物为F：5'-ACTGGGCATGGAG GATGCAG-3'和R：5'-CGCAAAGTGGAACCCATCG T-3'，PCR产物纯化后待用。SNaPshot的10 μL反应体系中包括 SNaPshot Multiplex 试剂5 μL、混合引物2 μL（389位点引物389F：5'-ttttttttttttttttttttttAGGTCAGGC AGTTGCGTTCAA-3'和774位点引物774R：5'-tttttttt ttttttttttttttttttttttATCGTCCGTGGCGAACACCA-3'）、PCR纯化产物混合模板2 μL、用ddH2O补齐。反应条件为95℃变性5 min、10个循环：95℃ 30 s、62℃降至 53℃ 30 s、72℃ 30 s， 接 30个 循 环：95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，72℃ 10 min。扩展产物经纯化后加1单位虾碱性磷酸酶（SAP）37℃孵育60 min，之后85℃ 15 min使酶灭活。纯化后的产物1 μL、Gene Scan-120 LIZ 标 品 0.5 μL（Applied Biosystems）和 HI-DI 8.5 μL混 合 后 ABI 3730测 序 仪（Applied Biosystems）上样。最终，测序结果用GeneMapper 4.0软件（Applied Biosystems）分析。

1.3 统计分析 1 212头中国荷斯坦奶牛是随机选择6个公牛的后代（206、199、196、191、208、212头个体），近年来没有对SCS及其他乳房炎抗性性状以及产奶性状进行过选择。奶牛分娩季节按每3个月分为4个季节：春季（3—5月，295头）、夏季（6—8月，314头）、秋季（9—11月，283头）、冬季（12—2月，320头）。

收集1 212头奶牛对应的公牛编号、牛场、产犊季节、SCS和5个产奶性状数据，利用以下统计模型对ITGB2基因不同基因型个体的SCS和产奶性状进行最小二乘方差分析[11-12]：

其中，yijklm表示基因型对应的测定值，μ代表群体均数，Bi代表第i头公牛的固定效应（i=1，2，3，4，5，6），Hj代表第j个牛场的固定效应（j=1，2），CSk代表第k个产犊季节的固定效应（k=1，2， 3，4），Gl代表第l种基因型的固定效应（l=1，2，3或1，2，3，4，5，6），eijklm为随机残差效应。利用SAS9.2软件Proc GLM（General Linear Model）过程完成。

2 结果与分析

2.1 389和774位点基因型及等位基因频率 在中国荷斯坦奶牛群体中检测到了ITGB2基因389和774位点多态性。如表1所示，C等位基因是2个位点的优势等位基因，CT和CC基因型分别是389和774位点的优势基因型。卡方检验显示中国荷斯坦奶牛研究群体在2个SNP位点上均处于哈代-温伯格平衡状态。

2.2 SNP效应与相关性分析 中国荷斯坦奶牛ITGB2基因2个SNP位点的效应如表2所示，774位点与乳蛋白率显著相关（P＜0.05），与其他5个性状无显著相关（P＞0.05），其中CC基因型个体乳蛋白率显著高于CT和TT型个体（P＜0.05）；389位点与6个性状均无显著相关（P＞0.05）。

2.3 复合基因型效应与相关性分析 如表3所示，中国荷斯坦奶牛ITGB2基因2个SNP位点共有6种复合基因型，复合基因型与乳脂肪率和乳蛋白率极显著相关（P＜0.01），与其他4个性状无显著相关（P＞0.05），其中CTCC和TTCC型个体具有高的乳脂率和乳蛋白率（P＜0.01），TTCC复合基因型个体具有相对低的SCS（P＞0.05）。

3 讨 论

对ITGB2基因研究较多的主要原因是该基因突变与LAD有关。在牛上，ITGB2基因编码区383位点突变A＞G[13]导致细胞外的高度保守区糖蛋白128位天冬氨酸被甘氨酸（D128G）取代[14]，致使白细胞表面的β2整合素表达缺陷，引起牛白细胞增多等BLAD先天性免疫缺陷病。ITGB2基因D128G突变也在巴基斯坦瘤牛和牛的杂交群体[15]以及印度的水牛群体[6]中发现。除了D128G突变外，ITGB2基因外显子5的6个突变，包括1个沉默突变（435C＞T）和5个错义突变（338T＞C[V113A]、340G＞T[A114S]、347A＞G[N116S]、348T＞C [N116S] 和359G＞A[R120Q]）也在巴基斯坦瘤牛和牛的杂交群体BLAD牛中检测到[15]。在狗上，在爱尔兰雪达犬LAD个体中检测到ITGB2基因107G＞C（C36S）突变[4,7]。在人上，ITGB2基因的诸多突变被报道，Fathallah等[9]在人近亲群体LAD患者中发现了ITGB2基因4个突变，Taghizade等[16]和Yassaee等[17]分别在伊朗LAD患者和LAD家庭ITGB2基因中发现了12个纯合子突变和14个突变。本研究中，利用SNaPshot技术在中国荷斯坦奶牛群体中检测到ITGB2基因2个无义突变389C＞T和 774C＞T。

表1 中国荷斯坦ITGB2基因2个SNP位点基因型、等位基因频率和哈代温伯格平衡检测

候选基因与性状的相关性分析能帮助揭示生产性状的遗传基础，并且与其他基因技术相比，该技术检测便捷且在育种过程中更容易操作[18]。就ITGB2基因而言，D128G突变是造成牛和水牛LAD的主要原因[6,15,19]。通过LAD患病个体与健康个体ITGB2基因序列比较，发现除D128G之外的其他突变与狗[4,7]和人[9]的LAD有关。在本研究中，相关性分析发现，前期在中国荷斯坦奶牛群体SCC极端个体ITGB2基因序列比对分析中发现的389C＞T和774C＞T突变与奶牛SCS无显著相关，说明这2个位点与BLAD无关，不能用于奶牛乳房炎抗性育种中；然而在774C＞T位点，携带CC基因型的个体比携带CT和TT基因型的个体乳蛋白率更高，说明774C＞T位点的CC基因型可以作为中国荷斯坦乳品质的一个潜在的分子标记。

众所周知，单个SNP的基因型可能会影响到临近SNP的基因型，复合基因型能够反映多个SNP间的互作[20]。因此，复合基因型的效应要优于单个基因型，这是因为基因型之间的连锁遗传效应较单个SNP更为高效[21]。本研究在中国荷斯坦群体ITGB2基因389C＞T-774C＞T位点发现了6种复合基因型，并且复合基因型与乳蛋白率和乳脂率极显著相关，其中CTCC和TTCC复合基因型个体有更高的乳脂率和乳蛋白率；更重要的是，TTCC复合基因型个体具有更低的SCS。该结果暗示在中国荷斯坦群体中增加ITGB2基因389C＞T-774C＞T位点TTCC基因型有望在提升乳品质的同时降低SCS。

表2 中国荷斯坦奶牛ITGB2基因2个SNP位点SCS和产奶性状的效应

表3 Smad3基因第6、7外显子与京海黄鸡体重的关联分析 g

4 小 结

本研究发现中国荷斯坦奶牛ITGB2基因389C＞T和774C＞T位点复合基因型主要与产奶性状而非乳房炎抗性有关。在奶牛育种中，ITGB2基因TTCC基因型是提高乳蛋白率、乳脂率和乳房炎抗性潜在的分子标记。