延黄牛ELOVL6基因cDNA序列克隆及其在各组织间的表达差异

胡忠昌，曹 阳，吴 健，秦立红，金海国，赵玉民*

（1.吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林公主岭 136100；2.延边大学农学院，吉林延边 133002）

超长链脂肪酸延伸酶家族（Elongase of Very Long Chain Fatty Acids，ELOVLs）可以催化饱和与单不饱和脂肪酸的延伸，是哺乳动物体内长链脂肪酸延伸和合成反应过程中所必需的酶。其中，ELOVL6基因在脂质含量较高的组织或者器官中（如肝脏、脂肪组织和肾上腺）表达较高。ELOVL6的主要功能是催化单不饱和脂肪酸的合成，也是治疗代谢性疾病的靶基因[1]，并且ELOVL6基因加剧肝脏的炎症反应和肝脏损伤，是导致非酒精性脂肪肝炎形成的重要因素[2]，是哺乳动物动脉硬化的主要参与基因[3]。ELOVL6基因是很重要的能量平衡因子，也是许多代谢性疾病的诱导因子[4]。Zhang等[5]在研究miRNA对ELOVL6基因表达的调控机制中发现，该基因在许多组织中广泛表达，尤其是在肾脏和肝脏组织中高表达，并且还发现鸡ELOVL6基因受miR-22-3P的影响来控制鸡肝脏脂质代谢。有学者对小鼠ELOVL6基因进行敲除后发现脂肪细胞中脂肪酸去饱和指数显著下降，在小鼠的肝脏和肺脏中亚油酸的含量也显著下降，这说明敲除小鼠ELOVL6基因能导致其对外源长链脂肪酸的摄取，以及引起脂肪细胞中亚油酸的明显减少[6]。在研究肉牛脂肪酸代谢和脂肪沉积中发现ELOVL6基因在PPAR和脂肪酸代谢信号通路中发挥重要的作用[7]。

“延黄牛”是我国经过27年选育而成的优秀肉牛品种，具有适应性强、生长速度快、产肉率高等优点，是延边具有鲜明地域特点和朝鲜族特色的高档肉牛品种[8]。本研究旨在分析延黄牛ELOVL6基因序列，明确其基因结构和在各组织间的表达差异，为延黄牛ELOVL6基因功能研究、肉用性能和经济性状的选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 延黄牛来源于吉林省珲春市吉兴牧业有限公司，屠宰后快速取心、肝、肺、肾、十二指肠、胃、背最长肌和皮下脂肪组织，用灭菌剪刀剪成小块，放入冻存管且做好标记，液氮保存。

1.2 引物设计与合成 按照说明书，用Trizol法提取延黄牛肝脏组织总RNA。根据 GenBank 中已发表的牛ELOVL6基因的序列信息（ NM_001102155.1），用Primer5软件设计得到 F、R，扩增后获得 ELOVL6基因 CDS 区。在核苷酸序列保守区内设计具有特异性的定量引物ELOVL6-FQ的上下游引物，以β-actin基因（GenBank登录号：NM_173979）作为内参基因，引物信息见表1。引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 ELOVL6基因RT-PCR扩增及克隆 RT-PCR反应体 系（50 µL）：2×ES Taq MasterMix 反 应 液 25 µL，cDNA 2.5 µL，上下游引物各取 1.25 µL，ddH2O 20 µL。PCR反应条件：95℃ 预变性2 min；95℃变性30 s；54℃退火45 s，72℃延伸30 s，共34个循环；72℃终延伸5 min，产物4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测正确后利用 DNA纯化回收试剂盒对PCR产物进行切胶回收，利用pMD-18T Vector将PCR胶回收片段克隆到T载体16℃连接30 min，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，加入LB培养液摇菌复苏1 h后，菌液涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）抗性的LB平板上，在37℃培养箱中过夜培养。随机挑取8份阳性单菌落，过夜摇菌，提取相应质粒，以提取的质粒为模板（1:105），按照ELOVL6基因扩增的引物和反应条件进行菌落PCR扩增鉴定。将鉴定结果正确的菌液送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.4 实时定量PCR反应体系及条件 QRT-PCR反应体系 20 µL：2×ES Taq MasterMix 反应液 10 µL，上、下游引物（10 µmmol/L）各 0.5 µL，模板 1 µL，灭菌蒸馏水8 µL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，从第2步开始45个循环；95℃ 5 s，65℃ 1 min，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到97℃最后降到40 ℃保存。

1.5 延黄牛ELOVL6基因生物信息学分析 将测序结果利用SeqMan软件进行序列拼接，获得延黄牛ELOVL6基因完整CDS序列，并通过EditSeq软件获得相应的氨基酸序列。利用DNAstar.Megalign软件对测序结果与原序列进行比对，再通过ExPASY.Protparam软件对测序结果进行蛋白理化特性分析。将氨基酸序列导入SWISS-MODEL软件中进行蛋白质三级结构以及蛋白信号肽分析心分析：利用NetPhos 2.0 Server软件对其进行磷酸化分析。

1.6 延黄牛ELOVL6基因在各组织间的表达差异分析以提取延黄牛各组织的cDNA为模板，进行实时定量荧光PCR，用Roche Lightcycler 480的相关软件对所得数据进行相关分析，通过分析可以直接得出ELOVL6基因和内参基因β-actin在各组织间的表达差异。

1.5 统计分析 每组试验重复3次，数据均以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 延黄牛总RNA提取及其电泳检测结果 经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪下观察。如图1所示，可以看到3条清晰的条带，从上到下依次为28S、18S和5S，可用于后续实验。

图1 延黄牛各组织总RNA的提取

表1 ELOVL6基因荧光定量PCR引物设计

2.2 延黄牛ELOVL6基因cDNA序列克隆及其相关生物信息学分析

2.2.1 目的基因RT-PCR扩增产物电泳后鉴定结果 如图2所示，目的条带明亮，可用于下一步实验。

图2 延黄牛ELOVL6基因RT-PCR产物扩增电泳图

2.2.2 目的基因重组质粒菌落PCR鉴定结果 如图3所示，所得条带长度为载体中插入的目的片段长度。

图3 延黄牛ELOVL6基因重组质粒菌落PCR电泳图

2.2.3 克隆延黄牛ELOVL6基因核苷酸序列测定结果延黄牛ELOVL6基因核苷酸序列：5'-GTAGCGACTCC GAAGATCAGCCCCAGTGAACATGTCAGTGTTGAC TTTACAAGAATATGAATTCGAAAAGCAGTTCAACG AGAATGAAGCCATCCAGTGGATGCAGGAAAACTG GAAGAAATCTTTCCTGTTTTCCGCCCTGTATGCTG CCTTTGTCTTTGGTGGTCGGCACCTAATGAACAAG CGGGCGAAGTTCGAGCTGAGGAGCCTTTAGTGCT CTGGTCTCTGACCCTTGCAGTCTTCAGTATATTCG GTGCTCTTCGAACTGGTGCTTATATGGTGTACACT GTGATGACCAAAGGCCTGAAGCATTCAGTTTGTG ACCAGGGTTTTTACAATGGACCTGTCAGCAAATTC TGGGCTTATGCATTTGTGCTAAGCAAAGCACCCGA ACTAGGAGATACAATATTCATTATTCTGAGGAAGC AGAAGCTGATCTTCCTGCACTGGTACCACCACATC ACTGTGCTTCTGTACTCCTGGTACTCCTACAAGGA CATGGTTGCTGGGGGTGGTTGGTTTATGACTATGA ACTATAGCGTGCACTCTGTGATGTACTCTTACTATG CCTTGCGAGCAGCAGGTTTCCGAGTCTCCCGGAA GTTCGCCATGTTCATCACGTTGTCCCAGATCATTC AGATGCTGATAGGCTGTGTCATTAATTACCTGGTCT TCCAGTGGATGCAGCATGACCAGTGTTACTCTCAC TTTCAGAACATCTTCTGGTCCTCACTCATGTACCTC AGCTACTTCGTGCTCTTCTGCCACTTCTTCTTTGA GGCCTACATCGGCAGCAAGATGAGGAAAGCAACG AAAGCTGACTAGTGTCGGAACTGAGGAGGAAGCC GTAGCTCAGGGTCATCAAGAAAAATAACAGACAA AAGAAAATGGCACAAGGGAATCACA-3'。

将克隆序列(YHCattle)与原序列(ELOVL6-CDS)进行比对，如图4所示，在第281 bp处有1个碱基缺失，973 bp处有1个碱基增添。将测序结果翻译为氨基酸序列与原氨基酸序列比对没有发现有氨基酸的突变（图5）。延黄牛ELOVL6基因核苷酸序列与在GenBank中人、猪、小鼠和羊核苷酸序列进行同源性比较，发现与山羊（NM_001314257.1）核苷酸序列的同源性为96%，而与小鼠（NM_130450.2）核苷酸序列的同源性仅仅只有15.3%（图6）。

图4 克隆序列与牛ELOVL6（NM_001102155.1）序列比对结果

图5 克隆序列与牛ELOVL6(NM_001102155.1)氨基酸比对结果

图6 延黄牛ELOVL6同源性分析和系统进化树

对延黄牛ELOVL6基因测序结果进行蛋白质三级结构分析，结果如图7所示，无α螺旋和β折叠。通过对延黄牛ELOVL6基因编码的氨基酸亲水性和疏水性进行分析，结果如图8所示，大多数氨基酸集中在疏水区且最大值接近2.5；对其进行磷酸化分析发现，该蛋白存在18个氨基酸磷酸化位点（分值＞0.5），分别为丝氨酸（Serine）12处、酪氨酸（Tyrosine）2处和苏氨酸（Threonine）4处（图9）。

图7 SWISS-MODEL预测延黄牛 ELOVL6蛋白三维结构模型

图8 延黄牛ELOVL6基因蛋白氨基酸亲水性分析结果

图9 延黄牛ELOVL6基因磷酸化位点分析

2.2.4 延黄牛ELOVL6基因在各组织间的表达差异分析

如图10所示，ELOVL6基因在延黄牛不同组织中的转录水平存在明显差异，在皮下脂肪组织中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.001)，在其他组织的表达量从高到低依次是肝、胃、肾、心、肺、肌肉和十二指肠。

图10 延黄牛 ELOVL6基因在各组织间的表达差异

3 讨 论

ELOVL6基因是一种重要的长链脂肪酸延伸和合成反应的限速酶，超长链脂肪酸在哺乳动物细胞膜形成、内分泌调节和细胞信号转导中起着关键调控作用，而棕榈酸可以进一步延伸成硬脂酸合成为超长链脂肪酸，ELOVL6是将棕榈酸转化成硬脂酸的限速酶，对ELOVL6基因的深入研究可以改善牛肉类中有益脂肪的组成[9]。在研究奶山羊乳腺上皮细胞中发现，ELOVL6基因影响细胞中单不饱和脂肪酸的生成，还发现该基因对脂滴积累没有影响，主要功能是催化C16脂肪酸延伸为C18脂肪酸[10]。肝脏和肌肉是脂肪酸代谢的重要合成部位， Zhang等[11]在研究猪肉质基因时发现，ELOVL6基因可能是猪第8号染色体肌肉C18:1n-9/C16:1n-7基因座位的候选基因。Takamura等[12]在小鼠体内敲除ELOVL6基因后发现胆固醇含量明显降低，这说明该基因的敲除能够抑制胞内脂质积累，增加胆固醇的排放，进而减少粥样斑块的形成，降低动脉硬化的发生几率。功能失调性脂肪酸在乙型糖尿病中β细胞功能性障碍和减少的发病机制中起重要作用[13]。ELOVL6基因可以通过修饰单不饱和脂肪酸来发挥在肥胖诱导的胰岛素抵抗中的作用。Zhao等[14]通过对瘦素受体缺陷型小鼠ELOVL6基因的敲除发现，小鼠体内β细胞显著增加，细胞凋亡减少，胰岛素的适应性增加和血糖控制得到改善，这就说明ELOVL6基因是脂质代谢调节异常与β细胞功能障碍，胰岛素炎症和β细胞凋亡联系起来的一个关键因素。

本研究首次克隆得到延黄牛 ELOVL6基因核苷酸序列，含有906 bp的开放阅读框，预测其编码264个氨基酸的多肽，预测分子量为31.282 ku，理论等电点为9.46，分子式为C1478H2171N355O362S18。其中酸性氨基酸：天冬氨酸（D）5个占1.9%，谷氨酸（E）9个占3.4%。碱性氨基酸：赖氨酸（K）17个占6.4%，精氨酸（R）9个占3.4%，组氨酸（H）9个占3.4%。疏水性氨基酸一共133个占50.37 %，这一结果与吴敏等[15]报道结果相近，说明延黄牛与奶山羊同源性相近，为了证实此结果，本实验对延黄牛 ELOVL6核苷酸序列与在GenBank中已公布的人、猪、小鼠和羊核苷酸序列同源性比较，发现与山羊（NM_001314257.1）核苷酸序列的同源性为96 %，而与小鼠（NM_130450.2）核苷酸序列的同源性仅仅只有15.3%，说明ELOVL6基因在不同品种间具有较强的保守性，与哺乳动物的进化水平接近，符合物种的进化规律。通过对克隆序列与原序列比对，发现在281 bp处有1个碱基缺失，973 bp处有1个碱基增添，为了证实该碱基缺失是否影响蛋白结构，将其核苷酸序列翻译成氨基酸序列，与原氨基酸序列比对未发生氨基酸的改变，说明该突变是同义突变，这一结果与陈煜[16]在研究秦川牛多态性所报道的结果一致。

本实验还检测了ELOVL6基因在延黄牛各组织间的差异表达，结果表明该基因在延黄牛皮下脂肪组织中的表达量极显著高于其他组织，说明该基因可能是调控脂肪酸代谢的关键基因，在肝脏和胃组织中也显著表达。肝脏是机体主要的代谢器官，发挥着去氧化、蛋白质的合成和储存肝糖等作用，胃是主要的消化器官，ELOVL6基因参与许多代谢反应所以在肝脏和胃中高度表达。本试验中，ELOVL6基因在其他组织的表达量从高到低依次是肾、心、肺、肌肉和十二指肠，这一结果与杨志刚等[17]报道结果一致。

目前对ELOVL6基因的研究主要集中在人类代谢疾病和人类癌症等方面，少数人在奶牛乳腺炎症、牛早期胚胎发育和脂肪酸代谢做过研究，而在牛肉质选育和肉牛遗传多态性分析方面研究甚少，加快对牛肉质基因的研究可能会为肉牛的遗传改良开辟新的方向，本实验对延黄牛ELOVL6基因CDS区克隆发现存在2个突变位点，且该基因在延黄牛皮下脂肪中显著表达，本课题下一步将对该基因SNP位点与延黄牛肉质性状的相关性进行研究，进一步探索该基因功能。

4 结 论

本实验成功获得延黄牛ELOVL6基因，共编码264个氨基酸的多肽，预测其分子量为31.282 ku，理论等电点为9.46，为疏水性蛋白，无典型的信息肽切割位点，含有18个氨基酸磷酸化位点（分值＞0.5），存在2个突变位点，没有引起氨基酸发生改变。延黄牛ELOVL6基因在各组织间存在差异表达，在皮下脂肪组织中表达量显著高于其他组织。综上所述，ELOVL6基因可能是影响牛脂肪酸代谢的关键调控基因，更深入地研究该基因将从分子遗传学角度为牛肉用性能和经济性状的选育提供参考依据。