酵母培养物对肉仔鸡生长性能及盲肠菌群的影响

甄玉国，陈 雪，赵 巍,，张学峰,，王 涛,，王晓磊，杨平平，李立佳

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司，吉林省饲料工程技术研究中心，吉林长春 130118；3.吉林农业大学吉农博瑞奶牛科技研发中心，吉林长春 130118；4.磐石市畜牧总站，吉林磐石 132300）

酵母培养物对肉仔鸡生长性能及盲肠菌群的影响

甄玉国1,2,3*，陈 雪2,3，赵 巍1,2,3，张学峰1,2,3，王 涛1,2,3，王晓磊4，杨平平4，李立佳1

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司，吉林省饲料工程技术研究中心，吉林长春 130118；3.吉林农业大学吉农博瑞奶牛科技研发中心，吉林长春 130118；4.磐石市畜牧总站，吉林磐石 132300）

研究在日粮中添加不同浓度的酵母培养物（YC）对肉仔鸡生长性能和盲肠菌群的影响，选用360只7日龄AA肉仔鸡，随机分成6个处理组，即对照组、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% YC组，每组6个重复，每个重复10只鸡。结果表明：日粮中添加YC对肉鸡的采食量没有显著影响（P＞0.05）；与对照组相比，日粮中添加0.8%YC显著提高了肉鸡的平均日增重、饲料转化率以及脂肪、钙和磷的表观利用率（P＜0.05）；在21日龄时，0.6%、0.8%、1.0%YC组瘤胃球菌属和丙酸杆菌属显著高于对照组（P＜0.05），添加YC后各组的拟杆菌属均显著高于对照组（P＜0.05），0.4%、0.6%、0.8%、1.0%YC组双歧杆菌显著高于对照组（P＜0.05），日粮中添加YC对肠杆菌科、梭菌目和鞘氨醇单胞菌没有显著影响（P＞0.05）；42日龄时，1.0%YC组瘤胃球菌属显著高于对照组（P＜0.05），0.8%和1.0%YC组梭菌目菌群含量显著高于对照组（P＜0.05），0.4%、0.6%、0.8%YC组拟杆菌和双歧杆菌显著升高（P＜0.05），但肠杆菌科数量减少（P＜0.05）；0.8%YC组显著增加鞘氨醇单胞菌数数量（P＜0.05）；丙酸杆菌数没有显著变化（P＞0.05）。因此，日粮中添加0.8%YC对肉鸡的生长性能和免疫功能效果最佳，日粮中添加适宜的YC可以增加有益菌的数量，降低有害菌的数量。

酵母培养物；肉仔鸡；生长性能；盲肠细菌

酵母培养物（Yeast Culture，YC）是一种成分复杂的微生态制剂，不仅含有酵母细胞内的营养物质，还含有发酵后形成的酵母细胞外代谢产物和未知的生长因子，目前已受到越来越多营养学家的关注[1]。许多研究表明，YC可以提高动物的生长性能，有效地调节家禽小肠和后肠中微生物的数量和比例[2-3]。动物的肠道菌群是一个复杂的微生态系统，肠道微生物在营养代谢、生理和免疫过程中起重要作用，其中盲肠微生物种类繁多且数量大，因此盲肠成为了关注的热点。由于传统的细菌培养手段具有局限性，因此本试验在前期PCR-DGGE测序的基础上，运用RT-PCR技术对肉鸡盲肠的瘤胃球菌属、梭菌目、丙酸杆菌属、双歧杆菌属及肠杆菌属进行定量分析，比较在日粮中添加YC后盲肠细菌的数量变化情况。

1 材料与方法

1.1 酵母培养物 本试验所用的YC是由吉林农业大学动物科学技术学院吉农博瑞奶牛研发中心提供。YC由酿酒酵母菌种以糖蜜为主要碳源的培养基经过10 L发酵罐发酵后获得最大生物量，然后移入50 L发酵罐厌氧发酵24 h，最后加入木瓜蛋白酶发酵36 h使得酵母菌体破壁。其中菌体干重为48.45 g/L，酵母菌破壁率为55.48%，YC干重达到226 g/L。

1.2 试验设计 选用360只预试至7日龄的AA肉仔鸡，根据体重相近原则随机分为6个处理组，每组6个重复，每个重复10只鸡，自由采食、饮水，舍内温度在预试期维持在32～36℃，以后每周降低2℃，最后达到室温。1～3日龄24 h光照，3日龄后逐渐递减为自然光照，同时每天记录采食量。对照组饲喂玉米-豆粕型粉料日粮配方参照赵巍[4]，试验组分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% YC （YC为湿重，干重分别为0.452‰ YC、0.904‰ YC、1.356‰ YC、1.808‰ YC、2.26‰ YC）。

1.3 生长性能测定 以重复为单位，分别在第7、14、21、28、35、42天早晨空腹称重，计算各组平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）：

ADG=（末重-初始重）／（天数×鸡只数）

ADFI=（投料量-剩料量）／（天数×鸡只数）

F/G=ADFI／ADG

1.4 日粮营养物质表观利用率测定 在第15、36天，每个重复随机挑出1只鸡进行代谢试验，预试4 d，在第19、40天起连续3 d进行全收粪，挑出粪便中皮屑、羽毛等杂质后立即称重，加入10%硫酸固氮后于-20℃保存。将3 d的混合粪样在65℃烘箱中烘干、粉碎。测定干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、钙（Ca）、总磷（P）的消化利用率，其中DM测定参照GB/T 6435-2006（饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定），CP测定采用凯氏定氮法；EE测定采用索式提取法进行测定；Ca使用原子吸收法进行测定；P使用钒钼酸铵显色法进行测定。

1.5 盲肠菌群分析

1.5.1 盲肠DNA提取 在21、42日龄时每个重复随机挑选2只鸡宰杀，将一侧盲肠结扎，在超净台中取出1 g左侧盲肠食糜，加入PBS振荡溶解后3 000 r/min低速反复离心取上清液，直到没有大颗粒固体食糜为止。收集上清液于1.5 mL经过高压处理的EP管中，12 000 r/min离心10 min后弃上清，然后加入1 mL PBS洗涤沉淀，此过程反复进行，直到上清液澄清，沉淀为白色为宜。细菌总DNA的提取方法参照杨朝晖等[5]。将每4只肉鸡盲肠提取的DNA混合，用于后续试验。

根据前期试验16S rDNA PCR-DGGE的测序结果，选择表1中细菌种进行荧光定量PCR，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以肉仔鸡盲肠总DNA为模板，运用表1中的特异性引物进行常规PCR扩增，PCR反应体系（25 μL）：1 μL DNA模板，1 μL引物（浓度10 μmol/L），2×Taq MasterMix 12.5 μL，用ddH2O补齐至25 μL。PCR扩增条件：95℃预变性2 min；95℃热变性30 s，60℃30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃终延伸5 min。PCR反应结束后用1%琼脂糖检测，应用Axyprep DNA 凝胶回收试剂盒将PCR产物进行纯化回收，具体操作参照试剂盒说明书。

将回收后的PCR产物与pMDTM18-T Vector连接并转入DH5α感受态细胞中[7]。同时用Axyprep质粒提取试剂盒提取质粒DNA，并测定浓度，换算成拷贝数[8]。

1.5.2 RT-PCR检测 将标准品呈10倍梯度稀释，每个梯度2个平行，制作标准曲线。每个试验组混合后的3个DNA模板进行RT-PCR反应，每个DNA样品2个平行。20 μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL；Forward Primer 0.8 μL；Reverse Primer 0.8 μL；ROX Reference Dye 0.4 μL；DNA template 2 μL；ddH2O 6 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15 s。反应结束后，以CT值为纵坐标，基因拷贝数的对数值为横坐标，计算二者的回归方程y=kx+b。通过未知样品的CT值，根据标准曲线的拟合方程，计算样品中DNA的拷贝数。

1.6 统计分析 通过Excel表格对试验数据进行整理，采用SPSS 17.0软件对各测定指标进行统计分析，均值的多重比较用LSD和Duncan's法进行，YC添加的剂量反应关系用正交多项式进行线性、二次和三次的趋势分析。

表1 Real-time PCR引物

2 试验结果

2.1 YC对肉鸡生长性能的影响 由表2可知，在试验前期（8～21 d），与对照组相比，日粮中添加YC对肉仔鸡的ADFI、ADG和F/G均没有显著影响（P＞0.05）；在试验后期（22～42 d），日粮中添加YC后ADFI和ADG均高于对照组，且0.8%YC组与对照组相比ADG提高了10.21%，F/G降低了5.85%（P＜0.05）；在整个试验期（8～42 d），日粮中添加YC对肉鸡的ADFI没有影响（P＞0.05），但添加0.8%YC时饲料转化率最高（P＜0.05）。同时，日粮中YC的添加量与肉鸡的生长性能并未出现剂量反应关系。

2.2 YC对肉鸡日粮营养物质表观利用率的影 由表3可以看出，在21日龄时日粮中添加YC增加了EE（线性，P=0.01；二次，P＜0.01；三次，P＜0.01）、Ca（三次，P＜0.01）的消化，EE的消化利用率分别比对照组提高了32.06%（P＜0.05）、35.29%、40.65%、39.62%和35.77%（P＜0.01），添加YC的各处理组间差异不显著（P＞0.05）；0.8%YC组Ca的消化利用率显著高于对照组、0.2%YC组和1.0%YC组（P＜0.05）；同时P的利用率也显著高于对照组（P＜0.05），其余各处理组间差异不显著（P＞0.05）。在42日龄时，日粮中添加YC后肉鸡EE的利用率均高于对照组（二次，P＜0.01；三次，P＜0.01），添加0.4%YC时达到了显著水平（P＜0.05），添加0.6%和0.8%YC时达到了极显著水平（P＜0.01），0.8%YC组显著高于0.2%YC组（P＜0.05）；添加YC并未影响Ca的表观利用率，而影响了P（线性，P＜0.01；二次，P＜0.01；三次，P＜0.01）的消化率，P在YC添加量为0.8%时达到最大值（P＜0.05），当添加1.0%YC时有降低的趋势；与对照组相比，日粮中添加YC对DM和CP的消化利用没有显著影响（P＞0.05）。

表2 YC对肉鸡生长性能的影响

表3 YC对肉鸡营养物质表观利用率的影响

2.3 常规PCR对特异性引物验证 以盲肠DNA为模板，利用不同引物对目的片段进行扩增，1%琼脂糖验证结果如图1所示。试验所应用的引物均有特异的扩增区域，目的条带清晰可见，特异性较好，可以进行后续的试验。

图1 7种引物常规PCR结果

2.4 各菌属Real-time PCR标准曲线 由表4可知，各标准品的稀释梯度与CT值建立了良好的线性关系，且Slope在-3.0～-3.6之间，由此可见，试验设计的7种特异性引物、反应条件及标准品的制备均符合了荧光定量PCR的要求，因此通过未知样品的CT值，根据标准曲线的拟合方程，计算未知样品中DNA的拷贝数。

2.5 饲喂不同浓度YC后不同细菌拷贝数的对数值 如表5所示，在21日龄时，与对照组相比，各处理组肠杆菌科、鞘氨醇单胞菌的菌群数量相对稳定，并未达到显著水平 （P＞0.05）；日粮中添加YC后，增加了盲肠中瘤胃球菌属和丙酸杆菌属的数量，且2种菌属的变化趋势相似（线性，P＜0.01；二次，P＜0.01；三次，P＜0.01），且0.6%、0.8%和1.0%YC组瘤胃球菌属和丙酸杆菌属均显著高于对照组（P＜0.05）；YC组梭菌目细菌数量呈现线性变化趋势（P=0.01），且0.8%和1.0%YC组显著高于对照组（P＜0.05）；YC组拟杆菌属的数量均显著高于对照组（线性，P＜0.01；二次，P=0.01；三次，P＜0.01）；添加YC后各处理组双歧杆菌数均高于对照组（线性，P＜0.01；二次，P＜0.01；三次，P＜0.01），且0.4%、0.6%、0.8%和1.0%YC组达到显著水平（P＜0.05）。

42日龄时，随着YC添加量的增加，肉鸡盲肠中瘤胃球菌属细菌数呈线性增加（P=0.02），且1.0%YC组达到显著水平（P＜0.05）；0.4%、0.6%和0.8%YC组拟杆菌和双歧杆菌呈二次（P＜0.01）、三次（P＜0.01）曲线趋势显著升高（P＜0.05），但肠杆菌科数量显著降低（P＞0.05）；与对照组相比，日粮中添加YC后盲肠鞘氨醇单胞菌数均升高，且0.8%YC组达到显著水平（P＜0.05）；日粮中添加YC后对盲肠中梭菌目和丙酸杆菌数没有显著影响（P＞0.05）。

表4 各菌属Real-time PCR标准曲线

3 讨 论

3.1 YC对肉鸡生长性能的影响 国内外大量研究表明，YC可以增加肉鸡的采食量，提高日增重改善其生长性能[9-10]。本试验中添加YC对肉仔鸡前期的生长性能没有影响，与Gao等[11]的添加YC提高了22～42日龄和整个试验期ADG和饲料转化率（FCR）的研究结果不同。Zhang等[12]研究指出，在0～5周龄肉鸡日粮中添加酵母细胞壁可以提高其增重，但对采食量没有显著影响。Reisinger等[13]研究表明，添加1 kg/t酵母抽提物（YD）可提高14～35日龄和1～35日龄的ADG。在本研究中，YC的添加量与肉鸡的生长性能没有明显的剂量反应关系，但添加1.0%YC后，肉鸡的ADG和FCR不如添加0.8%YC效果好，这可能是由于高剂量的YC促进了肉仔鸡的免疫功能，而机体在免疫功能升高的过程会消耗饲料中的营养物质和能量，使得饲料用于生长的营养物质部分降低，最终导致FCR下降。Shen等[14]关于YC对断奶仔猪的研究结果与本文相似。日粮中添加YC可提高粗蛋白、钙和磷的表观利用率，这可能是由于YC中含有较高活性的植酸酶，可分解饲料中的有机磷，从而促进肉仔鸡对于日粮中磷的消化利用。

3.2 YC对肉鸡盲肠菌群定植的影响 在本研究中，日粮中添加不同浓度的YC均不同程度地促进了梭菌目、瘤胃球菌、拟杆菌、丙酸菌、双歧杆菌等有益菌在盲肠的定植。21日龄的梭菌目细菌数及42日龄瘤胃球菌和梭菌目的细菌数量与YC呈线性关系，说明随着YC添加量的增加，瘤胃球菌属和梭菌目细菌的定植能力逐渐增大。此外，二者均属于硬壁菌门，经发酵作用可产生短链脂肪酸以及脂类等代谢产物，促进脂肪的沉积[15]，当YC的添加量为1.0%时，细菌数量达到最多，可能会增加肠道的负担，并不利于脂肪的代谢，这也解释了肉仔鸡日粮中添加YC与脂肪的代谢出现二次曲线关系的原因。42日龄时YC与双歧杆菌数出现二次曲线关系，1.0%YC添加量双歧杆菌数量较其他YC组有所降低，这可能是由于高剂量的YC过度的刺激盲肠微生物的发酵，产生更为复杂的代谢物，抑制有益菌的生长。

在42日龄时日粮中添加YC对肠杆菌科细菌的抑制效果更明显，且呈现二次和三次的剂量反应关系。这可能是由于随着鸡肠道的发育成熟，菌群逐渐变得复杂，更多类型的有益菌在肠道内定植，对有害菌的抑制效果更明显。此外，由于YC中的酵母细胞壁含有甘露糖和葡聚糖，这些物质可以与有害菌如大肠杆菌和沙门氏杆菌结合，能够阻止病原菌在动物肠细胞表面吸附，使其不能在肠黏膜上定植使其死亡并排除体外，相反有益菌更能有效地利用甘露糖[16]。同时，酵母培养物中含有的氨基酸、葡萄糖、维生素、有机酸等营养代谢物为有益菌的生长提供营养物质，保证有益菌的优势地位，通过自身产生的代谢产物如短链脂肪酸，能够降低肠道内的pH，进而抑制对酸度敏感的大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的增殖[17]，保护肠道健康发育。肖曼等[18]研究表明，日粮中添加不同浓度的YC均可降低盲肠中大肠杆菌的数量，这与本研究的结果相似。

此外，许多研究均指出鞘氨醇单胞菌可降解芳香类化合物[19-20]，这是由于鞘氨醇单胞菌可利用各种简单分子、降解复杂有机物，能够产生更多有价值的高分子物质（如冷凝胶、β-胡萝卜素），可淬灭与清除机体内产生的自由基[21]。本试验研究中，鞘氨醇单胞菌的检测数量与其他6种细菌数量相比最低，日粮中添加YC后，仅显著提高了42日龄0.8%YC组盲肠中鞘氨醇单胞菌的数量，同时与YC并未出现明显的剂量反应关系。然而鞘氨醇单胞菌是否会促进机体对营养物质的利用，或者产生了一些未知的代谢物，提高机体免疫能力，仍需进一步探究。

表5 饲喂不同浓度YC后不同细菌拷贝数的对数值 lg（拷贝数/g）

4 结 论

日粮中添加YC与肉鸡的生长性能并未出现明显的剂量反应关系，但添加0.8%YC对肉鸡平均日增重、饲料转化率及脂肪、钙、磷的表观利用率有较好的促进作用。另外，在日粮中添加适量的YC可以不同程度地改善肠道微生物群落，增加有益菌的数量，降低有害菌的数量。

[1] 田书会. 酵母培养物对夏季生长育肥猪肠道微生物发酵和区系及机体免疫功能的影响[D]. 南京:南京农业大学, 2011.

[2] 荣博涵. 酵母培养物对肉仔鸡生产性能与免疫功能的影响[D]. 长春:吉林农业大学, 2015.

[3] 郑艳秋, 甄玉国, 刘墨, 等. 酵母培养物对饲喂霉变玉米日粮肉仔鸡肠壁结构和肠道菌群影响的研究[J]. 饲料工业, 2010, (22): 34-36.

[4] 赵巍. 植物乳杆菌培养物对肉仔鸡生产性能和免疫功能的影响[D]. 长春:吉林农业大学, 2014.

[5] 杨朝晖, 肖勇, 曾光明, 等. 用于分子生态学研究的堆肥DNA提取方法[J]. 环境科学, 2006, (8): 1613-1617.

[6] 周丽沙, 李慧, 张颖, 等. 石油污染土壤鞘氨醇单胞菌遗传多样性16S rDNA-PCR-DGGE分析[J]. 土壤学报, 2011, (4): 804-812.

[7] 孙城涛. 健康与子宫内膜炎奶牛阴道菌群结构的比较研究[D]. 长春:吉林农业大学, 2014.

[8] 李旦. 肉牛瘤胃纤维分解菌RealTime PCR定量方法的建立与应用[D]. 乌鲁木齐:新疆农业大学, 2007.

[9] Wang Y B, Xu B H. Effect of different selenium source (sodium selenite and selenium yeast) on broiler chickens[J]. Anim Feed Sci Technol, 2008, 144(3): 306-314.

[10] Fasina Y O, Olowo Y L. Effect of a Commercial Yeast-Based Product (Maxigen®) on intestinal Villi Morphology and growth performance of broiler chickens[J]. Int J Poult Sci, 2013, 12(1): 9-14.

[11] Gao J, Zhang H J, Yu S H, et al. Effects of yeast culture in broiler diets on performance and immunomodulatory functions[J]. Poult Sci, 2008, 87(7): 1377-1384.

[12] Zhang A W, Lee B D, Lee S K, et al. Effects of yeast (Saccharomyces cerevisiae) cell components on growth performance, meat quality, and ileal mucosa development of broiler chicks[J]. Poult Sci, 2005, 84(7): 1015-1021.

[13] Reisinger N, Ganner A, Masching S, et al. Efficacy of a yeast derivative on broiler performance, intestinal morphology and blood profile[J]. Livest Sci, 2012, 143(2): 195-200.

[14] Shen Y B, Piao X S, Kim S W, et al. Effects of yeast culture supplementation on growth performance, intestinal health, and immune response of nursery pigs[J]. J Anim Sci, 2009, 87(8): 2614-2624.

[15] 郭秀兰. 猪肠道硬壁菌门和拟杆菌门数量的检测及其相对丰度与脂肪沉积的相关性研究[D]. 雅安:四川农业大学, 2009.

[16] Stanley V G, Gray C, Daley M, et al. An alternative to antibiotic-based drugs in feed for enhancing performance of broilers grown on Eimeria spp-infected litter[J]. Poult Sci, 2004, 83(1): 39-44.

[17] Zdunczyk Z, Juskiewicz J, Jankowski J, et al. Metabolic response of the gastrointestinal tract of turkeys to diets with different levels of mannan-oligosaccharide[J]. Poult Sci, 2005, 84(6): 903-909.

[18] 肖曼, 高振华, 李兴华, 等. 酵母培养物对肉仔鸡生长性能、肠黏膜结构及肠道菌群的影响[J]. 动物营养学报, 2013, (7):1624-1631.

[19] Pinyakong O, Habe H, Supaka N, et al. Identification of novel metabolites in the degradation of phenanthrene by Sphingomonas sp. strain P2[J]. FEMS Microbiol Lett, 2000, 191(1): 115-121.

[20] Rentz J A, Alvarez P J J, Schnoor J L. Benzo [a] Pyrene degradation by Sphingomonas yanoikuyae JAR02[J]. Environ Pollut, 2008, 151(3): 669-677.

[21] 胡杰, 何晓红, 李大平, 等. 鞘氨醇单胞菌研究进展[J].应用与环境生物学报, 2007, (3):431-437.

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-112

2016-11-09；

2016-12-06

吉林省重大科技攻关项目（2012ZDGG006）

甄玉国（1971-），男，吉林长春人，博士，副教授，主要从事反刍动物营养研究，E-mail: nickzhen@263.net

* 通讯作者