玉米赤霉烯酮对IPEC-J2细胞炎症相关因子mRNA表达和活性的影响

杨丽革，牟 洋，张 薇，李建平，单安山

（东北农业大学动物营养研究所，黑龙江哈尔滨 150030）

玉米赤霉烯酮对IPEC-J2细胞炎症相关因子mRNA表达和活性的影响

杨丽革，牟 洋，张 薇，李建平*，单安山*

（东北农业大学动物营养研究所，黑龙江哈尔滨 150030）

本试验旨在探讨玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）对仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）炎症相关因子mRNA表达和活性的影响。试验选取不同浓度（0～80 μg/mL）ZEN处理IPEC-J2细胞12、24、48 h，CCK-8法检测细胞存活率并计算得出半数抑制浓度（IC50）。根据IC50选取用不同浓度ZEN（0、5、10、15 μg/mL）处理细胞12、24、48 h，倒置显微镜下观察细胞形态，RT-PCR法测定炎症相关因子NF-κB、COX-2、PGES、IL-6、IL-8 mRNA的表达量，ELISA方法检测炎症相关因子的活性。结果表明：ZEN以时间和剂量依赖性降低IPEC-J2细胞存活率，12、24、48 h ZEN的IC50分别为41.09、28.54、19.85 μg/mL；随ZEN浓度升高和处理时间的延长，细胞形态被逐渐破坏；除COX-2的mRNA表达量和活性在12 h随ZEN浓度升高而升高外（P＜0.05），炎症相关因子mRNA表达量和活性均随ZEN浓度的升高呈先升高后降低（P＜0.05）；ZEN浓度和处理时间对炎症相关因子mRNA表达量和活性的影响均有极显著的交互作用（P＜0.001）。以上结果表明，ZEN能降低细胞存活率，破坏细胞形态，ZEN对细胞炎症相关因子mRNA表达和活性具有双向调节作用。

玉米赤霉烯酮；IPEC-J2；炎症相关因子

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是镰刀菌属产生的一种普遍存在于谷物和饲料中的霉菌毒素。ZEN具有细胞毒性、免疫毒性、生殖毒性、遗传毒性，同时与肿瘤产生也有一定的关联，而猪对ZEN尤为敏感。由于胃肠道既是养分消化吸收的主要部位，也是抵御摄入化学药物、食物污染以及天然毒素的第1道屏障，当ZEN污染过的饲粮被畜禽采食后，肠上皮细胞便成为ZEN首先作用的靶点[1]。仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）是分离自未吮乳的新生仔猪空肠上皮细胞，属于非转化性最初的连续培养小肠细胞系，具有典型的猪小肠上皮细胞特性[2]。因此，本试验选取IPEC-J2细胞为模型研究ZEN对炎症相关因子mRNA表达和活性的影响。

Wan等[3]研究表明，10 μmol/L或40 μmol/L ZEN处理IPEC-J2细胞48 h后能上调促炎症细胞IL-1α、IL-6、IL-8、TNF、MCP-1 mRNA的表达进而引起肠道炎症反应。Taranu等[4]研究表明，10 μmol/L ZEN作用于猪肠上皮细胞（IPEC-1）24 h后，炎症相关因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-12p40、CCL20的表达量升高。但是关于不同浓度的ZEN处理IPEC-J2细胞不同时间后对炎症相关因子的影响鲜有报道。本试验选取不同浓度和不同处理时间探讨ZEN对IPEC-J2细胞炎症相关因子NF-κB、环氧合酶2（COX-2）、前列腺素e2合酶（PGES）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）mRNA表达的影响，为下一步研究ZEN对细胞炎症反应作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 IPEC-J2细胞由中国农业大学提供。

1.1.2 主要仪器和试剂 二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；SA3300显微镜（北京泰克实验公司）；酶标仪（美国Tecan公司）；高速低温离心机（美国Sigma公司）；凝胶成像系统（美国UVP公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）等。

ZEN、乙腈（美国Sigma公司）；DMEM/F-12（1:1）培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素溶液（江苏碧云天生物技术研究所）；CCK-8（日本同仁化学研究所）；总RNA提取试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）；反转录试剂盒、RTPCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；ELISA试剂盒（上海恒远生物技术有限公司）。

ZEN加乙腈配制成10 mg/mL溶液，-20℃保存，备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 IPEC-J2细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，DMEM/F-12培养基中加入10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔1 d换1次培养基，待细胞贴壁生长到80%～90%时进行传代。

1.2.2 ZEN对IPEC-J2细胞的毒性作用 取对数生长期的细胞调整至5×104/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，置于培养箱中培养24 h后弃上清，每孔分别加入100 μL含ZEN（0、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL）的无血清培养基，分别继续培养12、24、48 h。培养时间结束后，每孔加入10 μL CCK-8，继续在培养箱中孵育4 h，培养结束后用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度值，记录结果，同时设空白对照组。所有试验孔和对照孔每组均设5复孔。

细胞相对存活率（%）=（试验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）

1.2.3 显微镜下观察细胞形态的变化 取对数生长期的细胞调整至1×106/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至80%左右，分别加入含ZEN（0、5、10、15 μg/mL）的无血清培养基，在培养箱中分别继续培养12、24、48 h，在显微镜下观察其形态变化。

1.2.4 炎症相关因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 mRNA表达量检测 总RNA的提取按试剂盒说明进行操作，提取的RNA置于-80℃备用。凝胶电泳检测RNA完整性，反转录和实时荧光定量PCR按试剂盒说明进行操作。根据GenBank上猪的基因序列设计引物采用GenBank Blast同源性检索后，由上海生工生物有限公司合成，引物详细信息见表1。mRNA的表达量采用-2△△Ct法计算，GAPDH为内参基因。

1.2.5 炎症相关因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8活性的检测 取对数生长期的细胞接种于12孔板中，按1.2.3处理细胞，用ELISA方法检测上清液中炎症相关因子的活性，操作均严格按照试剂盒说明操作。

1.3 统计分析 试验结果用SPSS 19.0软件进行统计学分析，IC50用非线性回归拟合计算方法计算，采用Duncan's法进行多重比较，ZEN和时间的交互作用采用一般线性模型进行分析，各组数据结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，P＜0.001作为差异极显著性判断标准。

表1 引物序列及参数

2 结 果

2.1 ZEN对IPEC-J2细胞的毒性作用 由表2可见，ZEN能显著降低IPEC-J2细胞的存活率（P＜0.05），并呈时间-剂量依赖关系。ZEN处理IPEC-J2细胞12、24、48 h后其IC50分别为41.09、28.54、19.85 μg/mL。根据48 h时IC50选取ZEN浓度为0、5、10、15 μg/mL，研究ZEN对细胞炎症相关因子mRNA表达和活性的影响。

2.2 显微镜下细胞形态的变化 由图1可见，对照组的IPEC-J2细胞呈铺路石状，是规则的肠上皮细胞形态。5 μg/mL ZEN时，12、24 h细胞形态呈铺路石状，48 h细胞形态稍有改变。10 μg/mL ZEN时，12 h细胞形态为铺路石状，但细胞间隙变大；24、8 h细胞形态大小不一、开始出现大量空隙、细胞膜模糊化的形态。15 μg/mL ZEN时，细胞形态极其不规则、分辨不清细胞核、半数细胞悬浮并裂解成更小的碎片。

表2 ZEN对IPEC-J2细胞存活率的影响

图1 细胞形态的变化（10×）

2.3 ZEN对IPEC-J2细胞炎症相关因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 mRNA表达的影响 由表3可知，ZEN添加量对NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 mRNA表达量影响极显著（P＜0.001）；处理时间对NF-κB影响显著（P＜0.05），对PGES、COX-2、IL-6、IL-8影响极显著（P＜0.001）；ZEN添加量与处理时间交互作用极显著（P＜0.001）。

随ZEN浓度升高NF-κB mRNA表达量先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）。5、10 μg/mL ZEN处理组表达量随时间增加而降低（P＜0.05），15 μg/mL ZEN处理组12 h表达量显著高于24、48 h表达量（P＜0.05）。

随ZEN浓度的升高PGES mRNA的表达量先升高后降低（P＜0.05）；12 h时，10 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）；24、48 h时，5 μg/mL ZEN处理组的表达量最高（P＜0.05）。5 μg/mL ZEN处理组24、48 h表达量显著高于12 h表达量 （P＜0.05），10、15 μg/mL ZEN处理组12 h表达量显著高于24、48 h表达量（P＜0.05）。

12 h时，COX-2 mRNA表达量随着ZEN浓度的升高而升高（P＜0.05）；24、48 h时，随ZEN浓度的升高COX-2 mRNA表达量先升高后降低（P＜0.05）；24 h时，10 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）；48 h时，5 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）。5 μg/mL ZEN处理组48 h表达量最高（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组12、24 h表达量显著高于48 h表达量（P＜0.05），15 μg/mL ZEN处理组表达量随时间增加而降低（P＜0.05）。

随着ZEN浓度的升高IL-6 mRNA表达量而先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）。5、10 μg/mL ZEN处理组表达量随时间增加而升高（P＜0.05），15 μg/mL ZEN处理组12 h表达量显著高于24、48 h表达量（P＜0.05）。

随着ZEN浓度的升高IL-8 mRNA表达量先升高后降低（P＜0.05）；12、48 h时，10 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）；24 h时，5 μg/mL ZEN处理组表达量最高（P＜0.05）。5 μg/mL ZEN处理组24 h表达量最高（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组表达量随时间增加而降低（P＜0.05），15 μg/mL ZEN处理组12 h表达量显著高于24、48 h表达量（P＜0.05）。

表3 ZEN对IPEC-J2细胞炎症相关因子mRNA表达的影响

2.4 ZEN对IPEC-J2细胞炎症相关因子NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8 活性的影响 由表4可知，ZEN添加量和处理时间对NF-κB、PGES、COX-2、IL-6、IL-8活性影响极显著（P＜0.001）；ZEN添加量与处理时间交互作用极显著（P＜0.001）。

随ZEN浓度升高NF-κB活性先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组活性最高（P＜0.05）。对照组24 h活性最高（P＜0.05），5、10、15 μg/mL ZEN处理组活性随时间增加而降低（P＜0.05）。

随ZEN浓度的升高PGES活性先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组活性最高（P＜0.05）。对照组24 h活性最高（P＜0.05），5、15 μg/mL ZEN处理组12 h活性最高 （P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理组活性随时间增加而降低（P＜0.05）。

12 h时，COX-2活性随着ZEN浓度的升高而升高（P＜0.05）；24、48 h时，COX-2活性随ZEN浓度的升高先升高后降低且5 μg/mL ZEN处理组活性最高（P＜0.05）。对照组12、24 h活性显著高于48 h活性（P＜0.05），5、10、15 μg/mL ZEN处理组活性随时间增加而降低（P＜0.05）。

IL-6活性随着ZEN浓度的升高而先升高后降低（P＜0.05），10 μg/mL ZEN处理活性最高（P＜0.05）。对照组活性随时间增加而降低（P＜0.05），5、10 μg/mL ZEN处理组活性随时间增加而升高（P＜0.05），15 μg/mL ZEN处理组24 h活性最高（P＜0.05）。

随着ZEN浓度的升高IL-8活性先升高后降低（P＜0.05）；12、24 h时，10 μg/mL ZEN处理组活性最高（P＜0.05）；48 h时，5 μg/mL ZEN处理组活性最高（P＜0.05）。对照组、5 μg/mL ZEN处理组24 h活性最高（P＜0.05），10 、15μg/mL ZEN处理组活性随时间增加而降低（P＜0.05）。

3 讨 论

IC50是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度，是反映细胞对化学药效的一个重要指标。因此本试验首先观察ZEN对细胞存活率的影响，为ZEN对细胞毒性效应的研究提供理论基础。研究表明，ZEN对不同动物种属、不同细胞均会产生细胞毒性，且IC50随不同细胞和不同处理时间会有所变化[5]。本试验得出，12、24、48 h ZEN的IC50分别为41.09、28.54、19.85 μg/mL。

NF-κB是一种重要的核转录因子，参与炎症的发生，在机体的组织和细胞中广泛存在，能诱导多种细胞因子和炎症介质的基因表达，调控炎症级联效应，还可调控免疫反应，参与细胞内信号传导[6]。COX-2在肠道炎症反应过程中发挥着十分重要的作用，与NF-κB的结合位点存在于COX-2的启动子部位[7]，因此COX-2的转录激活必须经由NF-κB位点调控。目前存在的3种PGES相关酶包括cPGES、mPGES1、mPGES2，促炎症细胞因子能上调培养细胞中的mPGES-1和COX-2并能通过COX-2/mPGES1途径生成PGe2，进而引起炎症反应[8]。IL-6是由多种免疫细胞或非免疫细胞产生的多效的前炎症细胞因子。IL-8是由吞噬细胞或间冲质细胞通过炎症、感染、局部缺血等刺激下产生的趋化分子。NF-κB表达量上调时，可诱导产生多种促炎症细胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-1、IL-8等）[9]。本试验结果表明，ZEN能通过上调炎症相关因子的活性的从而发生炎症反应。高浓度ZEN或作用时间延长PGES、COX-2和IL-6 mRNA的表达与对照组相比显著降低，但蛋白活性没有显著降低。mRNA表达水平与蛋白活性之间的差异，可能是受到分子转录后或翻译后调控机制影响，或是应用于蛋白质定量试验技术的灵敏度没有转录水平测定mRNA含量的灵敏度高[10]。

表4 ZEN对IPEC-J2细胞炎症相关因子活性的影响

关博[11]研究表明，0～25 μg/mL ZEN处理鸡脾脏淋巴细胞48 h后，NF-κB、COX-2 mRNA的表达量均随毒素浓度升高而升高；Jia等[12]研究表明，用（0.3～146.0 mg/kg）ZEN饲喂妊娠期SD大鼠20 d后，肾脏中IL-6和NF-κBp65 mRNA和蛋白表达量随ZEN浓度增加而增加；Bouhet等[13]研究表明，0～100 μmol/L伏马菌素B1（Fumonisin B1，FB1）处理IPEC-1细胞72 h后，IL-8的mRNA和蛋白表达量均随浓度增加而降低；范小龙等[14]研究表明，低浓度ZEN（1 μg/mL）能显著促进小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-10，而高浓度ZEN（10、25 μg/mL）均能极显著抑制小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-10。史嘉瑜[15]研究表明，SD大鼠腹腔注射ZEN 3-96 h后卵巢中NF-κB的蛋白表达量在3 h时最高；Krishnaswamy等[16]研究表明，10 μmol/L DON处理人结肠癌细胞（HT-29）1～6 h后，NF-κB的蛋白表达量先升高后下降，处理10～24 h后，COX-2的表达量同样先升高后降低。可以看出部分霉菌毒素的不同浓度和处理时间对炎症相关因子的影响具有双向调节作用，低浓度的霉菌毒素或处理时间较短能促进炎症相关因子的产生，高浓度的霉菌毒素或处理时间较长反而抑制其产生。本试验关于ZEN浓度或者作用时间对炎症相关因子产生的结果与前人研究结果一致。可能是由于低浓度的毒素能上调细胞因子、趋化因子、炎症相关基因的表达同时发生免疫刺激，高浓度毒素或处理时间较长可能通过诱导细胞凋亡而抑制免疫细胞、免疫因子及抗体的形成等方式发生免疫抑制[17]。

为了更深一步探究ZEN对细胞炎症相关因子表达的影响，可以选择更多时间和浓度范围来研究，从而系统地得出不同浓度ZEN处理不同时间炎症相关因子的表达规律，为下一步研究ZEN对细胞炎症反应作用机理提供理论依据。

4 结 论

ZEN以时间依赖性和剂量依赖性降低IPEC-J2细胞存活率，在12、24、48 h的IC50分别为41.09、28.54、19.85 μg/mL。随ZEN浓度升高和处理时间的延长，细胞形态被逐渐破坏。ZEN对细胞炎症相关因子mRNA表达和活性具有双向调节作用。

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Effect of ZEN on mRNA Expression and Activity of Inflammation Related Factors in IPEC-J2 Cells

YANG Li-ge, MU Yang, ZHANG Wei, LI Jian-ping*, SHAN An-shan*
(College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Heilongjiang Harbin 150030, China)

The purpose of this study was to evaluate the effects of ZEN on mRNA expression of inflammation related factors in IPEC-J2. Cells were treated with different concentrations of ZEN (0～80 μg/mL) for 12, 24, 48 h. Cell viability was estimated by CCK-8 assay and the IC50 was calculated. After cells were treated with different concentrations of ZEN (0, 5, 10, 15 μg/mL) for 12, 24, 48 h, the changes of cells morphology were observed and the mRNA expression of NF-κB, PGES, COX-2, IL-6, IL-8 were detected by RT-PCR. The results showed as follows: the cell viability was reduced in a dose/time-dependent manner, IC50 of ZEN were 41.09, 28.54 and 19.85 μg/mL, respectively. With the increasing of ZEN concentrations and the extension of treatment time, the morphology of cells was gradually destroyed. In addition to the COX-2 mRNA expression increased with dose dependent of ZEN at 12h (P＜0.05), the mRNA expression increased first then decreased with the concentration increased (P＜0.05). When ZEN concentration was 5 μg/mL, the NF-κB in 12 h, PGES and IL-8 in 24 h, IL-6 and COX-2 in 48 h mRNA expression highest; when ZEN concentration was 10 μg/mL, the NF-κB, PGES and IL-8 in 12 h, COX-2 in 24 h, IL-6 in 48 h mRNA expression highest; when ZEN concentration was 15 μg/mL, all inflammation related factors mRNA expressed highest in 12 h. The interactions of ZEN concentration and treatment time on the expression of inflammatory cytokine mRNA was highly significant (P＜0.001). The current findings indicated that ZEN could reduce cell viability and destroy cell morphology, ZEN had dual regulatory functions in expression of inflammation related factors.

Zearalenone; IPEC-J2; Inflammation related factors

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-075

2016-11-29；

2017-01-20

国家重点研发计划（2016YFD0501207）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-36）；动物普通疾病防治重点实验室开放课题

杨丽革（1990-），女，河南濮阳人，硕士研究生，主要从事动物营养与饲料科学研究，E-mail：ylgpy123456@

163.com

* 通讯作者：李建平，副教授，硕士生导师，E-mail：ljpneau @163.com；单安山，教授，博士生导师，E-mail：asshan@ neau.edu.cn