DNA甲基化/去甲基化与哺乳动物胚胎的体外发育

苏文龙，李璐，曹慧，倪俊卿，马亚宾，李俊杰，3*

（1.河北农业大学动物科技学院，动物医学院，河北保定071000；2.河北省畜牧良种工作站，河北石家庄050061；3.河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北保定071000）

DNA甲基化/去甲基化与哺乳动物胚胎的体外发育

苏文龙1，李璐1，曹慧1，倪俊卿2，马亚宾2，李俊杰1，3*

（1.河北农业大学动物科技学院，动物医学院，河北保定071000；2.河北省畜牧良种工作站，河北石家庄050061；3.河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北保定071000）

DNA甲基化及去甲基化是哺乳动物表观遗传修饰的主要方式之一，与哺乳动物胚胎的发育密切相关。因此深入研究DNA甲基化与去甲基化的发生机制，对于改善早期胚胎的发育具有重要意义。本文对哺乳动物胚胎早期发育过程中的DNA甲基化动态修饰进行了综述。

DNA甲基化；DNA去甲基化；胚胎；体外发育

DNA甲基化/去甲基化与哺乳动物胚胎的发育密切相关，其可通过基因沉默、印迹清除和重建、X染色体失活等方式作用于胚胎发育。大量研究证实，胚胎的早期发育阶段是DNA甲基化水平变化最强烈的阶段之一，如在此期间发生DNA甲基化的异常，则会导致胚胎的死亡及出生后各种遗传病的发生。研究表明，DNA甲基化水平过高很可能是其体外发育能力和质量低下的重要原因［1-3］。可见，DNA甲基化修饰在胚胎发育过程中起着重要的作用。本文对此加以综述，以便于深入探讨DNA甲基化/去甲基化与胚胎体外发育的关联机制。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（Dnmts）的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基基团转移到DNA特定核苷酸碱基上的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化修饰主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶残基上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），在基因组中呈不均匀分布。通常将基因组中CpG二核苷酸丰富的区域称为CpG岛，这些CpG岛主要分布在基因的5′端，如启动子区域、非翻译区及第一外显子区域。DNA甲基化与基因的表达呈负相关，甲基化程度越高，基因的表达程度越低。其机制当胞嘧啶被甲基化后，5-mC则突出至DNA双螺旋大沟中，从而干扰了转录因子与DNA结合；甲基化CpG岛可与序列特异性甲基化连接蛋白或甲基化CpG结合蛋白结合，导致转录因子不能与基因形成转录复合物［4］，致使基因不能转录。

Dnmts家族是与DNA甲基化修饰密切相关的酶类，目前认为，Dnmts家族包括Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L，在小鼠中，从受精卵原核期到1-细胞期，Dnmt1低浓度分布于胞质中，从2-细胞开始，散布于整个细胞［5］。Dnmt1对于胚胎的早期发育是必要的，负责维持印迹基因的甲基化模式，其缺乏或者过量均会导致胚胎的死亡［6］。另外，胚胎形成过程中，在许多种基因序列中可通过Dnmt3a和Dnmt3b催化发生全新甲基化，Dnmt3a-/-小鼠在出生4周后死亡，Dnmt3b-/-小鼠在出生前死亡［7］。可见，Dnmts在早期胚胎发育中是不可或缺的。

2 DNA去甲基化

DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶（5-mC）被胞嘧啶代替的过程，可分为主动去甲基化与被动去甲基化。被动去甲基化常见于细胞分裂S期，DNA复制时维持性甲基转移酶类失活，进而导致新合成的DNA链未被甲基化。主动去甲基化则是在相关酶的作用下，将甲基基团移去的过程。在哺乳动物的个体发育中，配子发生和早期胚胎的发育期均涉及了基因组范围的主动去甲基化反应［8］。但哺乳动物中引起DNA主动去甲基化的酶及相关机制尚存在争论。综合起来，主要有以下几种潜在机制：①存在切除5-mC的DNA转葡糖基酶，切除5-mC产生脱嘌呤嘧啶位点（AP位点），进而启动碱基切除修复途径，用胞嘧啶C取代5-mC，最终完成DNA的去甲基化。研究发现，一些从Hela细胞核抽提物中纯化的酶可以通过DNA转葡糖基酶机制起始DNA的去甲基化［9］。②存在特异性识别5-mC的脱氨酶，通过脱氨作用将5-mC转变成胸腺嘧啶，形成G/T错配。进而由识别G/ T错配的糖苷酶启动碱基切除修复途径，完成DNA的去甲基化。③通过核苷酸切除修复（NER）途径切除含有5-mC的一段DNA，并用含有未修饰胞嘧啶的同样序列进行替换，进而完成DNA的去甲基化。④通过氧化作用完成DNA去甲基化。Tahiliani等［10］发现，DNA双加氧酶Tet1蛋白在体外可以将5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），最终转化成非甲基化的胞嘧啶。⑤通过水解作用由氢原子取代甲基基团，实现DNA去甲基化。

3 DNA甲基化与胚胎发育

在哺乳动物的个体发育中，从受精至着床前的早期胚胎发育期DNA甲基化谱式经历了一次大规模的重编程过程［8］。受精后会经历一次整个基因组范围内的DNA去甲基化事件，然后依据动物种类不同，在胚胎发育的某一时期（大部分在桑椹胚或囊胚期）会发生一次全基因组范围内的DNA重新甲基化。DNA甲基化通过作用于基因（尤其是印记基因）的表达来影响早期胚胎的生长发育。受精后的DNA甲基化变化对哺乳动物早期胚胎的发育起着决定性作用［1］。

3.1 体外受精（IVF）胚胎发育过程中DNA甲基化的动态变化哺乳动物成熟的精子和卵母细胞的基因组均是高度甲基化的，受精后二者发生了广泛的去甲基化和染色质结构的重构，从而使精子和卵母细胞DNA上截然不同的遗传外标记被重塑成了一种胚胎模式。研究发现，受精后6～8 h小鼠雄原核会快速发生DNA主动的去甲基化［11］；与之相比，雌原核的去甲基化则是逐步、被动和DNA复制依赖性的，并且发生于受精卵第一次DNA复制和细胞分裂后，这与细胞核中维持DNA甲基化水平的酶——Dnmtl的丢失有关。在小鼠、大鼠、猪、牛和人类的受精卵中，均存在雄原核快速主动去甲基化的过程［12］，但在绵羊、山羊和兔受精卵中未发现此现象，这可能是不同物种间的差异造成的。

随后受精卵发生卵裂，同时继续发生DNA去甲基化。小鼠体外受精胚胎DNA甲基化水平从2-细胞逐步降低一直持续到桑椹胚阶段；牛受精卵基因组首先发生主动去甲基化，之后甲基化水平进一步下降直到8-细胞期［2］。绵羊体外受精胚胎从2-细胞期到4-细胞期，甲基化水平没有明显下降，8-细胞期呈现明显的低甲基化状态［13］；猪的去甲基化过程发生于受精后至4-细胞阶段［1］；人类体外受精胚胎在桑椹胚阶段甲基化水平降至最低［14］。

附植前胚胎发生重新甲基化的时间因动物种类不同而存在差异，小鼠胚胎的重新甲基化开始于囊胚阶段，而牛16-细胞期时甲基化水平开始上升［2］，猪的重新甲基化起始于8-细胞时期［9］，绵羊桑椹胚时甲基化水平明显上升［13］，人体外受精胚胎重新甲基化通常起始于早期囊胚［14］。

在囊胚阶段，内细胞团（inner cell mass，ICM）将发育成不同的组织和器官，其特异的甲基化模式，对于植入后胚胎的发育是至关重要的。对不同动物早期胚胎甲基化模式研究发现，小鼠、牛、绵羊的囊胚内细胞团细胞DNA甲基化水平明显高于滋养层细胞［2-3］，但在人［14］、恒河猴［15］、兔［16］的囊胚中，内细胞团细胞DNA甲基化水平低于滋养层细胞。这种现象存在的原因，一方面可能是因为早期胚胎DNA甲基化模式存在物种间差异。另一方面可能是因为胚胎的体外培养条件对早期胚胎DNA甲基化水平造成的影响［1］。

3.2 核移植胚胎体外发育过程中DNA甲基化动态变化核移植胚胎的生产需将一个已分化的、高甲基化水平的体细胞反分化恢复全能性，在此过程中供体体细胞去甲基化显得尤为重要，另外在核移植胚胎发育过程中其DNA甲基化水平也发生了一系列动态变化，因此核移植胚胎的发育也与DNA甲基化密切相关。大量研究证实，核移植胚胎的低生产效率、高死亡率和高流产率与其在不同发育阶段表现出异常的DNA甲基化模式密切相关［1-3］。利用间接免疫荧光染色方法已经在小鼠、牛、绵羊、猪、恒河猴等物种上检测不同发育阶段的核移植胚胎与体外受精胚胎的DNA甲基化水平之间的差异，与体外受精胚胎相比，核移植胚胎的多个发育阶段均表现出较高的DNA甲基化水平［1-3］。

在牛的核移植早期胚胎中观察到了不完全的去甲基化事件。Dean等［2］发现，牛核移植胚胎在1-细胞期出现主动性的去甲基化，但随后并没有发生被动性去甲基化，反而在4～8-细胞期出现从头甲基化，致使桑堪胚期卵裂球的甲基化状态与供核细胞（成纤维细胞）相似。其原因可能是体细胞核中的Dnmtl仍然存在于核移植胚胎中，阻止发生被动的去甲基化。Beaujean等［3］发现，其2～8-细胞期的核移植胚胎中染色体的形态特征与供体细胞相似，并表现过高的甲基化水平。囊胚中内细胞团细胞甲基化水平高于滋养层细胞，但核移植囊胚中滋养层细胞甲基化水平显著高于体内胚滋养层。Deshmukh等［1］实验表明，猪核移植胚胎中1-细胞、2-细胞、4-细胞阶段甲基化水平显著高于体内胚胎相应阶段，但从4-细胞到8-细胞阶段甲基化水平显著下降，8-细胞阶段甲基化水平达到最低；早期囊胚和晚期囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞甲基化水平均没有显著差异，但显著高于8-细胞阶段胚胎。

以上研究表明，大多数哺乳动物核移植胚胎在植入前呈过度甲基化状态，导致了核移植重构胚重新编程顺序的紊乱，这可能是导致核移植胚胎发育能力低下的主要原因之一。故在体细胞核移植过程中，核移植胚胎附植前建立正确的甲基化模式对于克隆动物正常发育是必须的。因此，通过何种方法使附植前核移植胚胎甲基化水平趋于正常，从而达到提高核移植胚胎发育效率，已成为科学研究的热点。

4 DNA甲基化转移酶抑制剂在胚胎发育过程中的应用

在体细胞核移植实验中要求供体细胞从分化状态转变成具有支持胚胎发育能力的全能性细胞，这就需要重新思考怎样在体外降低细胞基因组DNA的甲基化程度，从而提高供体细胞、重构胚的重编程效率，恢复细胞的全能性状态。这对提高核移植获得的重构胚的发育潜能，提高克隆效率，具有重要的意义。因此，通过抑制DNA甲基转移酶活性，阻断DNA的高度甲基化来降低体细胞及核移植重构胚甲基化程度的思路已经越来越多地受到重视，DNA甲基转移酶抑制剂逐渐用于核移植重构胚的重编程，从而提高核移植效率。以甲基转移酶为靶点的DNA甲基转移酶抑制剂根据其化学结构可分为核苷类和非核苷类两大类。其中核苷类甲基转移酶抑制剂主要有阿扎胞苷（5-azacitidine）、5-氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-dC）、折布拉林（zebularine）、法扎拉滨（fazarabine）等。而目前在体细胞核移植中应用最多的是5-氮-2′-脱氧胞苷。

4.1 5-氮-2′-脱氧胞苷在核移植中的应用利用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC处理供体细胞，能有效降低其甲基化水平。李俊杰等［17］研究表明，用浓度为0.01 μmol/L的5-aza-dC处理体细胞和融合后的重构胚，能够提高山羊体细胞核移植胚胎囊胚率。Huan等［18］研究发现，与对照组相比，用25 nmol/L的5-aza-dC处理重构胚24 h，能够显著提高猪囊胚率。但是也有研究表明供体细胞经5-aza-dC处理后能降低甲基化水平，但是并不能提高核移植胚胎的发育率。同一种DNA甲基转移酶抑制剂在不同动物核移植中去得到完全不同的结果，除了物种的差异外，很大程度上可能是因为该药物具有的毒副作用。多项研究证实，5-aza-dC本身有一定的毒性，Chai等［19］报道，5-aza-dC具有细胞毒性和致突变效应。并且在水溶液中的半衰期短，影响了这些药物的递送。虽然5-aza-dC在一定程度上可以提高核移植效率，但是由于其具有一定的毒性从而影响了使用效果。

4.2 DNA甲基转移酶抑制剂Zebularine在体细胞核移植中应用的研究与5-aza-dC相比，另一核苷类甲基转移酶抑制剂Zebularine拥有更低的毒性，和更高的稳定性，半衰期也较长，在中性水溶液中非常稳定。Cheng等［20］研究发现，zebularine对Dnmts的抑制表现出很高的选择性。因此，zebularine也可以应用到体细胞核移植中，降低供体细胞和核移植重构胚的甲基化水平，从而提高核移植效率。Diao等［21］实验表明，分别用经过5 nmol/L的5-aza-dC，zebularine处理的供体细胞进行核移植后，囊胚率显著高于对照组，并且zebularine的处理效果优于5-aza-dC的处理效果。Saha等［22］研究表明，使用浓度为5 nmol/L的5-aza-d C和zebularine处理核移植重构胚，zebularine组的囊胚率显著高于5-aza-dC实验组的囊胚率。因此，在核移植胚胎生产中，zebularine是比5-aza-dC更好的选择。

综上所述，哺乳动物胚胎的发育过程中，DNA甲基化修饰发挥着重要的作用，但是关于DNA甲基化的启动机制和作用机理仍需进一步研究。随着分子生物学技术的发展尤其是荧光实时定量PCR、基因芯片的应用，将拓宽对DNA甲基化在胚胎发育中作用的认识。同时，深入研究体细胞和卵母细胞的DNA甲基化修饰，选择合适的去甲基化药物利于完善生物重编程机制，对改善动物体细胞核移植技术和辅助生殖技术将具有重要意义。

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Relationship between DNA Methylation/Demethylation and the in vitro Development of Mammalian Embryos

SU Wen-long1,LI Lu1,CAO Hui1,NI Jun-qing2,MA Ya-bin2,LI Jun-jie1,3*
（1.College of Animal Science and Technology,College of Veterinary Medicine,Agricultural University of Hebei, Hebei Baoding 071000,China；2.The Hebei Provincial Station for Livestock Varieties Producing and Spreading, Shijiazhuang 050061,China；3.Research Center of Cattle and Sheep Embryo Engineering Technique of Hebei,Hebei Baoding 071000,China）

DNA methyla tion/demethylation,one of the chief ways of epigenetic modification,is closely related to the mammalian embryo development.Therefore,making further research for the mechanism of DNA methylation/ demethylationhas important significance for improving the development of early embryos.This paper summarizes the dynamic modification of DNA methylation during the development of mammalian embryos.

DNA methylation；DNA demethylation；embryo；in vitro development

S814.2

A

0258-7033（2015）09-0068-04

2014-05-09；

2014-07-04

河北省自然科学基金（C2014204119）；河北省现代农业产业技术体系奶牛产业创新团队资助

苏文龙（1988-），男，河南焦作人，在读硕士研究生，主要从事动物繁殖调控研究，E-mail：suwenlong198865@163.com

*通讯作者：李俊杰，男，博士，教授，E-mail：lijunjie816@163.com