动物肠道营养物质吸收的研究方法进展

刘飞飞，秦贵信*，孙泽威，王涛，于文雅，张琳，孙喆，袁志杰

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118；3.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118）

动物肠道营养物质吸收的研究方法进展

刘飞飞1，2，秦贵信1，2*，孙泽威1，王涛1，于文雅1，2，张琳1，2，孙喆3，袁志杰1，2

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118；3.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118）

肠道是营养物质吸收的主要场所，营养物质在肠道内的消化吸收是决定养分高效利用的重要因素。科学的肠吸收研究方法可以明确肠上皮对营养物质的有效吸收部位、吸收效率及吸收机制，并获得营养物质在肠道的吸收动力学参数。本文对目前应用较多的在体法（血管插管法和小肠灌注法）及体外法（外翻肠囊法、刷状缘膜囊法、尤斯灌流法和体外细胞模型法）进行了综述，为营养物质的吸收研究提供参考。

肠道；养分吸收方法；血插管；小肠灌注；外翻肠囊；体外细胞模型

小肠是营养物质吸收的主要部位，营养物质经过小肠上皮细胞的吸收转运机制共有4种：被动转运、膜动转运、载体偶联转运和细胞旁路通路转运［1-2］。营养物质的转运是一个非常复杂的过程，某种营养物质的转运形式可能是一种，也可能是多种。但根据转运至肠腔内的营养物质的种类、理化性质和数量、被消化酶的降解程度以及吸收部位形态结构和小肠通透性的不同，其吸收机制也会有相应改变［3-4］。在神经体液机制的调控下，胃肠道及机体各个部分协调配合才能使营养物质全面有效地被吸收。以往研究营养物质吸收方法主要是体内法，但体内试验法不能全面的了解某种营养物质的吸收动力学情况。随着科学技术的发展，许多用于研究药物吸收的方法也广泛的应用于动物营养学研究，主要有在体法（in situ）和体外法（in vitro）。本文对近年来动物营养物质吸收研究的方法及应用进行了综述。

1 在体法

在体法研究营养物质的吸收的优点是能够提供完整的小肠、血液系统和神经系统以及影响养分吸收的酶和转运载体，但是这种方法需要有复杂的外科手术技术，难度较大。

1.1 血插管法动物机体的营养代谢是一个不断变化的动态过程。近几年，在动物营养生理研究工作中需要深入研究机体组织器官的代谢变化时，研究者采用多血重血插管（门静脉、肠系膜静脉、肝静脉、股静脉和股动脉血管）技术来定量地研究各种营养物质和活性物质在动物体内的变化，系统地了解营养物质代谢物进入或流出某器官或组织的总量，结合血流量即可获得营养物质在某组织的转运情况。血插管技术能够比较全面地评价机体的代谢状况，对国内外动物营养研究工作具有重要意义。目前，以猪和羊为实验动物的颈动脉-门静脉-肠系膜静脉插管手术已较为成熟［5-6］。Zeng等［7］给猪进行肝门静脉血管瘘手术，在猪采食前后的不同时间点取门静脉血液，发现日粮不同赖氨酸水平显著影响生长猪门静脉血清氨基酸及血液生化指标的变化。Li等［8］采用门静脉和颈动脉血插管技术研究发现日粮淀粉来源影响葡萄糖和氨基酸的吸收利用，其中玉米淀粉组、糯米淀粉组、糙米淀粉组和抗性淀粉组采食8 h后门静脉氨基酸净吸收量分别为63.76%、61.80%、59.81%和48.39%，并且抗性淀粉组较其他组葡萄糖的吸收率低。戴求仲［9］采用多重血插管技术研究不同淀粉来源的日粮对生长猪门静脉葡萄糖、氨基酸、挥发性脂肪酸及乳酸净吸收量的影响，比较分析了不同消化速率的淀粉对营养物质吸收时间和剂量的差异，从而为合理的搭配谷物饲料与蛋白质饲料的平衡提供理论指导。王子荣等［10］采用多重血插管技术研究外源性半胱胺对山羊门静脉血液和激素流量，碳氮化合物肠道吸收及肝脏代谢的影响，探讨了外源性半胱胺在山羊体内的吸收代谢动力学特征。由上述研究可以发现，血插管技术在研究机体复杂的营养代谢的动态过程中具有独特优势，通过这种技术可深入了解营养物质在动物机体内肠道吸收动力学的差异机制，为科学地研究营养物质的吸收利用提供技术支持。

1.2 小肠灌注法小肠灌注法已经广泛应用于各种营养物质的吸收研究。此种方法可以直接测定营养物质从灌注肠段中进入肠壁和机体的量。小肠灌注法实验的优点是在动物血管和神经的支配下，养分透过肠上皮细胞后被血液运走，更接近于动物正常的生理状态，而较其他体内的方法，此方法能研究不同肠段的吸收机制。于红霞等［11］给山羊从十二指肠瘘管灌注亮氨酸，发现不同浓度的亮氨酸可直接长期调控山羊胰腺α-淀粉酶的分泌，从而影响养分的吸收利用。哈斯额尔敦［12］采用十二指肠瘘管研究奶牛瘤胃后泌乳所需的18碳脂肪酸的需要量，研究表明，亚麻酸与油酸和亚油酸均可显著改变乳脂脂肪酸组成，为进一步日粮调控乳脂组成提供理论依据。

2 体外法

2.1 外翻肠囊法Wilson等［13］利用外翻肠囊法研究小肠的吸收和代谢以来，该技术逐渐应用于动物营养学研究，尤其在肠道营养物质转运领域得到应用［14］。该方法一般采用10 cm左右的小肠段进行实验［15］，用缓冲液冲洗去除内容物后将肠段外翻形成肠囊，并向肠囊中注入不含待测物的培养液，然后置于含有待测物的孵育液中，同时通入95%O2和5% CO2的混合气体，孵育一定时间后，根据肠囊内外待测物质的变化来反映肠道对该物质的吸收情况。但是随着孵育时间的延长，肠黏膜上皮的完整性逐渐受到破坏，因此，肠黏膜细胞的持续存活时间是关键。研究表明［16］，肠黏膜形态结构在37℃有氧孵育5 min后会产生明显的变化，随着孵育时间的延长，肠黏膜边缘逐渐受到破坏。有研究报道，与普通大鼠相比，23℃孵育条件下金色仓鼠的外翻肠囊的肠上皮完整性持续时间更长。

外翻肠囊法也广泛的应用于动物体内葡萄糖、氨基酸、维生素和矿物质等营养物质的转运。Mahomoodally等［17］采用外翻肠囊法孵育不同浓度的苦瓜提取物，研究大鼠上皮组织对葡萄糖、酪氨酸吸收的能力。Berge等［18］利用外翻肠囊法研究大西洋鲑鱼体外氨基酸吸收动力学，结果发现L-蛋氨酸在孵育液中的浓度较低时（2.5 mmol/L），其吸收受到其他氨基酸的抑制，而高浓度时（10～25 mmol/L），单独蛋氨酸的吸收和与其他氨基酸共同吸收的效率相同，然而去除孵育液中其他的中性氨基酸时，蛋氨酸的吸收受到明显抑制。许多研究者利用外翻肠囊法培养动物肠道研究微量元素的吸收情况。计峰等［19］用外翻肠囊法研究肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠对无机锰和有机锰的吸收特点，研究发现回肠是肉仔鸡小肠吸收锰的主要部位，且体外培养的小肠各段外翻肠囊中有机态锰的吸收率比无机形态的锰高。外翻肠囊法因操作简单、快速、重复性好、试验条件容易控制而被广泛应用于研究某种营养物质的吸收特点，但该方法不能完全模拟动物体内肠道的生理特征，故实验结果可能会有一定误差。

2.2 尤斯灌流法丹麦学者Ussing等［20］首次利用尤斯灌流（Ussing Chamber）法研究蛙的皮肤上皮组织中Na+离子的转运，随后Ussing Chamber作为体外模型应用于胃肠道内药物的吸收和代谢［21］。Ussing Chamber是根据电压钳原理设计出的专门用于研究上皮组织电生理属性的仪器，主要由2个部分组成，即灌流室和电路系统，另有配套的软件、数据处理系统及计算机显示系统。取一段动物肠段去除肌层，置于Ussing Chamber灌流室中，灌流室分为上下两个小室，通过不同的时间段检测连于两室的回路电流或通过同位素来研究营养物质在两室之间跨膜转运过程。其中两室内溶液的构成、浓度以及温度等都应根据具体需要进行控制。

近几年，该技术广泛应用于动物胃肠道营养物质转运及胃肠道黏膜屏障功能的研究，主要集中在葡萄糖、小肽、氨基酸以及钙磷等矿物元素的转运方面。Michiels等［22］采用Ussing Chamber方法研究了麝香草酚和反式-肉桂醛对猪空肠Na+依赖性D-葡萄糖、L-丙氨酸的吸收和Cl-的分泌，结果发现麝香草酚和反式-肉桂醛对空肠葡萄糖和氨基酸的吸收呈剂量依赖性，1 mmol/L的反式-肉桂醛显著减少葡萄糖和氨基酸的吸收率。Awad等［2］采用Ussing Chamber方法研究饲喂菊糖后的仔猪葡萄糖穿过空肠中段的电生理转运，结果表明，菊糖可能通过增加断奶仔猪空肠粘膜的通透性，改变肠黏膜屏障功能，从而提高葡萄糖的吸收。不同品种动物胃肠道吸收矿物质的机制存在显著差异，大量研究采用Ussing Chamber方法研究矿物质的转运吸收。Wilkens等［23］采用Ussing Chamber系统比较研究了山羊和绵羊小肠Ca2+的吸收机制的差异。研究表明，与绵羊相比，山羊对低钙食物的适应能力较强，而这种适应能力主要受激素的调节增加小肠钙的吸收，特别是在空肠，以弥补低钙饮食的供给，而山羊瘤胃钙转运既不受日粮钙浓度的影响，也不受钙三醇的调节。而研究者［24］采用Ussing Chamber方法研究低钙饮食引起山羊而不是绵羊血浆中钙三醇浓度升高并且引起瘤胃钙吸收增加。对于以上研究差异的原因需要进一步的试验证实。

以上研究表明，Ussing Chamber法已经被广泛的应用于胃肠道上皮组织的通透性和离子转运，并且也应用于不同化合物的吸收机制，用来评价不同营养物质间的相互作用。然而，这种方法不适用于对兔肠道上皮细胞养分的转运的研究，因为兔十二指肠和空肠组织太厚，不适用于Ussing Chamber系统离子扩散［25］。

2.3 刷状缘膜囊法刷状缘膜囊（BBMV）是通过一定方法来提取肠上皮细胞顶膜，然后在特定缓冲液中重新环化为球状的膜囊，在膜囊表面均匀分布着一些营养物质的转运载体，如Na+葡萄糖共转运载体、氨基酸转运载体及肽类转运载体等，利用分离的BBMVs可以研究由载体介导的营养物质转运的调节。此方法是研究转运载体动力学特性常用的方法，由于刷状缘膜囊（BBMV）存在大量的活性细胞膜载体，因此保留了足够有效的转运活性［26］；而且BBMV模型还能避免细胞代谢、底物呈递、细胞渗透压等的影响，所以测量值相对更为精确。目前，较常用分离BBMV的方法是CaCl2和MgCl2沉淀法［27］。黄骞［28］利用Ca2+沉淀法获取了纯化的BBMV，来研究谷氨酰胺、葡萄糖在刷状缘膜的转运及载体表达的变化，发现低灌流组肠刷状缘Na+依赖性葡萄糖的转运及其载体表达明显下降，而谷氨酰胺则未见明显变化。肖英平等［29］研究表明，谷氨酰胺通过提高断奶仔猪空肠刷状缘膜碱性磷酸酶活性及调控肠道健康因子的表达来提高仔猪的生产性能。国内外研究多采用BBMV法研究小肠葡萄糖的吸收能力［30，4］，Woodward等［31］采用BBMV法比较研究了马和猪的肠道葡萄糖转运能力，表明马的空肠D-葡萄糖的吸收能力比猪低。目前，还有较多的应用BBMV法进行糖尿病的发病机理的研究。

2.4 体外细胞模型小肠上皮细胞（Intestine Epithelium Cells，IEC）参与了肠道的消化、吸收、内外分泌及免疫屏障等功能。目前，培养动物和人的肠上皮细胞被广泛应用于营养及分子细胞学研究。体外分离培养小肠上皮细胞对于研究肠道内细胞间的信号转导以及IEC增殖和分化机制等方面具有重要意义［3］。

体外细胞模型为研究多种营养素在小肠的吸收机制提供了一个有效且易于操作的实验手段。近十几年来，国内外已普遍采用组织细胞模型来研究营养物质的吸收，包括Caco-2细胞单层模型、Caco-2/ HT29-H细胞共培养模型及IPEC细胞模型等。其中尤其是Caco-2细胞模型以其与人体内营养物质研究的良好相关性，被普遍应用于肠道营养物质的吸收研究［32，1］。同时，国内外也采用组织块和酶消化法原代分离培养不同种属动物小肠上皮细胞研究动物体内营养物质的吸收利用［33-34］。相振田［35］采用体外分离培养的猪小肠上皮细胞为模型，研究不同淀粉体外酶解产物对猪肠上皮细胞葡萄糖转运载体基因表达的影响，结果发现饲喂高直链淀粉和支链淀粉比例的豌豆淀粉增加小肠上皮细胞葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2基因的表达，从而增加肠道内葡萄糖的吸收利用率，有利于仔猪肠道的健康。Wasa等［36］采用体外培养的肠上皮细胞株研究谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺等氨基酸营养物质的转运，发现其转运速率下降，并推测这可能是由于细胞膜上活性氨基酸转运单位表达下降引起的。

胃肠道pH值和胃肠道的酶类直接影响营养物质吸收，因此，采用体外模拟消化与细胞模型相结合，进行营养物质转运的研究，模拟营养物质吸收的生理环境，可以更准确地预测某种养分在体内的生物利用度。Yun等［37］也利用体外模拟消化与Caco-2细胞相结合研究提高了铁的生物利用度，与动物实验结果具有很好的相关性，证实了这一模型的可行性。与实验动物相比，体外细胞模型比饲养动物更经济省时，且干扰因素较少，试验结果的重现性较好。

3 小结

综上所述，采用在体及体外研究方法对营养物质吸收进行研究已经被广泛应用，这样可以定性、定量地研究营养物质在肠道的吸收动力学、吸收机制、有效吸收部位及影响吸收的因素等信息，为某种营养物质的高效利用、减少饲料资源的浪费提供更科学的理论依据。

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Advance in Study Methods on Nutrients Absorption in Animal Intestine

LIU Fei-fei1,2,QIN Gui-xin1,2*,SUN Ze-wei1,WANG Tao1,YU Wen-ya1,2, ZHANG Lin1,2,SUN Zhe3,YUAN Zhi-jie1,2
（1.College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China；2.Key Laboratory of Animal Production,Product Quality and Security,Ministry of Education,Jilin Agricultural University, Tilin Changchun 130118,China；3.College of Life Science,Jilin Agricultural University,Tilin Changchun 130118,China）

The intestine is the main site of nutrients absorption.Th e digestion and absorption in the intestine had been recognized as critical factors in determining the efficient utilization of nutrients.The methods of intestinal absorption could show that absorption sites,absorption efficiency,absorption mechanism and the absorption kinetics parameters in the intestine.Various methods of studying nutrients absorption main including in situ（vessel catheter and intestinal perfusion）,and in vitro（everted gut sac,BBMVs,ussing chamber and cell models）were reviewed in this paper,which should offer the references for the study of nutrients absorption.

intestine；methods of nutrient absorption；vessel catheter；intestinal perfusion；everted gut sac；cell models

S814.2

A

0258-7033（2015）09-0081-05

2014-09-22；

2014-11-17

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2013CB127306）；国家自然科学基金项目，（31072037）

刘飞飞（1985-），女，吉林长春人，博士生，主要从事动物营养学研究，E-mail：feikathy@163.com

*通讯作者：秦贵信，教授，博士生导师，E-mail：qgx@jlau.edu.cn