水牛转录因子Sox2和Lin28克隆与表达研究

邹灵秀，邓彦飞，陈凤，乔树叶，杨素芳，石德顺（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

水牛转录因子Sox2和Lin28克隆与表达研究

邹灵秀，邓彦飞*，陈凤，乔树叶，杨素芳，石德顺*
（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

本研究克隆水牛特异性转录因子Sox2和Lin28，构建表达载体，为进一步研究2个基因在水牛干细胞多能性调控中的作用奠定基础。以胎牛生殖嵴总RNA为模版，采用RT-PCR扩增Sox2和Lin28的编码区序列（CDS），构建逆转录表达载体pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28，转入NIH3T3细胞，鉴定其表达情况。结果表明：水牛Sox2和Lin28的CDS全长分别为966 bp和618 bp，蛋白结构保守；Sox2、Lin28氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为96%、95%、94%、94%和98%、97%、89%和91%；pMSCV介导的Sox2和Lin28能在NIH3T3细胞中表达。

水牛；转录因子；克隆；真核表达

家畜干细胞的分离、培养和建立干细胞系可以为家畜育种改良研究提供细胞资源。利用水牛干细胞介导的定点整合转基因技术生产遗传性状优良的水牛新品种是解决低繁殖力、低产奶量等遗传缺陷的重要手段之一。对水牛干细胞多能性相关基因及其信号调控网络的研究，可以建立水牛干细胞系。Sox2和Lin28是与干细胞多能性相关的转录因子，在维持干细胞自我更新和多能性的作用中发挥重要作用，与Oct4和Nanog等构成干细胞调控通路的核心转录因子［1］。

Sox2主要在干细胞和神经系统中表达，敲除Sox2的早期胚胎，会因为上胚层发育受阻而死亡，或者不能分离形成胚胎干细胞［2］。Lin28是一个RNA结合蛋白，可以提高某些特异mRNAs的稳定性，在早期胚胎和胚胎干细胞中高表达，在分化的细胞中低表达［3］。Yu等［4］采用Sox2、Lin28结合Oct4和Nanog 4个转录因子，将人类成纤维细胞重编程成为诱导多能干细胞（iPSCs），充分显示了Sox2和Lin28在干细胞多能性调控中的重要作用。目前，Sox2和Lin28基因编码区的克隆研究在小鼠［1］、人［2］、羊［5］和猪［6］等物种上有相关报道，在水牛上尚未有报道。本研究克隆和分析水牛Sox2和Lin28基因的CDS序列，构建表达载体，并在NIH3T3细胞中表达，为水牛iPSCs的生产以及转录因子在水牛干细胞中的调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂配方水牛胎儿（3月龄左右）取自南宁市屠宰场；E.coli DH5α感受态菌株为本实验室保存；pMSCV载体系统购自Clontech公司；NIH3T3细胞购自ATCC公司；pMD18-T克隆载体、Taq酶、内切酶（EcoRⅠ和XhoⅠ）和T4连接酶等购自大连宝生物工程有限公司；感受态细胞和反转录试剂盒购自Transgen；DNA Marker、RNA提取试剂盒、琼脂糖、DNA胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；质粒去内毒提取试剂盒购自QIAGEN；胎牛血清（FBS）、DMEM细胞完全培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液、青链霉素和G418等购自Gibco公司；脂质体转染试LTX剂购自Life公司；引物合成和序列测定在上海生工进行。

DNA序列分析使用NCBI/GenBank数据库；引物设计使用Oligo 6.0引物设计软件；序列拼接使用DNA Star/SeqMan软件；同源性分析使用Clustalx和Blast软件；蛋白结构和功能预测使用SMART在线分析软件；进化树分析和绘制使用DNAMAN软件。

1.2 RT-PCR克隆Sox2和Lin28编码区获取胎牛生殖嵴，采用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒合成cDNA（反转录条件：25℃10 min，42℃30 min，90℃5 min，4℃forever）。根据GenBank上报道的各物种Sox2和Lin28的基因序列，分别经过多重比较。Sox2参照牛（NM001105463.1）、猪（EU503117.1）的序列，Lin28参照猪（NM_001123133.1）、羊（KC994650.1）的序列，分别设计特异性引物，以cDNA为模板扩增水牛Sox2和Lin28的编码区（Sox2F-GAATTC ATGTACAACATGATGGAGACG，Sox2R-CTCGAGTCA CATGTGCGAGAGGGGC退火温度为62℃，下划线分别为EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点；LinF-GAATTCATG GGCTCTGTGTCAAACCAG，LinR-CTCGAGTCAATTCTG GGCCTCTGGGAG，退火温度为62℃，下划线分别为EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点）。将目的片段经过胶回收纯化之后，分别连接到pMD18-T载体上，测序验证后，最终获得pMD18-T-Sox2和pMD18-T-Lin28重组质粒。1.3pMSCV表达载体的构建将pMD18-T-Sox2和pMD18-T-Lin28均采用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切；胶回收纯化后，用T4连接酶，将Sox2和Lin28分别连接到同样采取相同内切酶酶切后的pMSCV载体上；经过大肠杆菌质粒转化后，采用无内毒素试剂盒提取质粒，双酶切鉴定，最终获得表达Sox2和Lin28的重组质粒（pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28），-20℃保存供细胞转染用。

1.4 细胞培养将NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系在37℃水浴锅中解冻，接种到60 mm细胞培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中扩大培养。NIH3T3完全培养基为DMEM基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL。采用浓度为2.5 mg/mL的胰酶消化传代。

1.5 质粒转染NIH3T3细胞将NIH3T3细胞接种到60 mm的细胞培养皿上，待细胞生长到70%左右汇合度时，使用LTX脂质体进行转染。pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28重组质粒分别进行转染。转染前4 h改换无血清无抗生素的DMEM 3 mL。转染具体步骤如下：在1 mL无血清无双抗DMEM中加入5 μg重组质粒和7.5 μL Plus，混匀；室温孵育5 min，加入10 μL LTX，混匀，室温孵育30 min后滴加到包装细胞培养皿里；4～6 h后改换DMEM完全培养基继续培养。

1.6 阳性转基因细胞的筛选和表达鉴定NIH3T3转入目的基因24 h后，将细胞按照1∶4的比例进行传代，同时在完全培养基中加入250 μg/mL G418对转基因细胞进行筛选。经过2～3周的筛选后，挑取阳性克隆进行扩大培养，采用RT-PCR检测Sox2和Lin28基因在NIH3T3中mRNA的表达情况。收集阳性细胞，PBS洗3次，分别提取RNA，DpnⅠ消化残留DNA后反转录成cDNA，并以此为模板，使用下列引物进行扩增：Sox2 F：CAACTCGGAGATCAGCAAGC；Sox2 R：GTTCA TGTAGGTCTGCGAGC（退火温度60℃；扩增长度454bp）；Lin28 F：GGTTCGGCTTCCT GTCCATGA；Lin28 R：CAGT TTGCATTCCTTGGCATGAT（退火温度64℃，扩增长度307 bp）。未经过转基因操作的NIH3T3总RNA反转录为cDNA后作为阴性对照。扩增产物采用凝胶电泳进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 Sox2和Lin28基因的克隆以水牛生殖嵴来源的反转录cDNA为模板，扩增Sox2和Lin28的编码区序列全长，经过凝胶电泳后，成像系统显示Sox2基因编码区条带大小为966 bp，Lin28基因编码区条带大小为618 bp（图1）。将Sox2和Lin28连接到pMD-18T载体上，获得重组载体pMD18-T-Sox2和pMD18-TLin28，经过酶切鉴定后获得相应大小的目的片段（图2）。Sox2和Lin28经过测序验证后提交到GenBank，分配的基因序列号分别为Sox2：JN986576，Lin28：JN986575。

图1 Sox2和Lin28基因的扩增

2.2 Sox2和Lin28基因序列分析使用在线生物软件SMART分析水牛Sox2和Lin28序列的蛋白质结构。结果表明，水牛Sox2含有其家族特有的HMG结构域和3个低重复序列，Lin28含有冷休克蛋白结构域（CSP）和2个C2HC型锌指结构域。对水牛Sox2和Lin28氨基酸序列分析发现，氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应蛋白高度保守，Sox2、Lin28相似性分别为96%、95%、94%、94%（图4）和98%、97%、89%、91%（图5）。

2.3 表达Sox2和Lin28重组表达载体的构建将pMD18-T-Sox2和pMD18-T-Lin28载体经过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，回收Sox2和Lin28片段，连接到经过相同双酶切的pMSCV载体上，获得重组表达载体pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28。最后经过双酶切鉴定，获得预期大小的目的片段（图6）。

图2 pMD18-T-Sox2/Lin28载体构建和酶切鉴定

图4 水牛Sox2进化树分析

图5 水牛Lin28进化树分析

2.4 表达Sox2和Lin28细胞克隆的鉴定采用脂质体法，将pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28分别转入NIH3T3细胞，G418筛选阳性克隆。结果表明，经过2～3周的筛选培养基培养，可以获得表达Sox2和Lin28的NIH3T3细胞克隆。挑选和扩大培养细胞克隆，RT-PCR鉴定外源基因的表达，结果表明所筛选的阳性克隆在mRNA水平上表达Sox2和Lin28（图7）。

3 讨论

诱导多能干细胞技术的诞生给建系困难的家畜干细胞提供了获取干细胞的新方式。目前已经报道的家畜诱导多能干细胞包括猪［6］、羊［7］和牛［8］等，尤其来源于猪诱导多能干细胞嵌合体后代［9］和克隆猪［10］的诞生，给家畜诱导多能干细胞运用于动物种质资源改良技术提供有力证据。本研究克隆和分析诱导多能干细胞相关转录因子Sox2和Lin28，构建重组表达载体，并在NIH3T3细胞中成功表达，这些研究将为水牛诱导多能干细胞的生产和研究相关转录因子在水牛干细胞中的作用机制奠定基础。

图6 pMSCV-Sox2/Lin28表达载体的构建和酶切鉴定

图7 阳性克隆的筛选和表达鉴定

Sox2是Sox（SRY-related HMG box-containing）基因家族的一员，含有该家族保守的HMG box结构域，可以结合特异性的DNA序列。Sox2是一个与干细胞多能性相关的重要转录因子，降低胚胎干细胞中Sox2的表达，会导致胚胎干细胞分化。与胚胎干细胞多能性维持相关的基因受到Sox2的调控，如Sox2的HMG结构域和Oct4的POU结构域共同结合到靶基因的启动子区，形成HMG/POU/DNAs三元复合物，调控靶基因的表达［11］。Lin28是一种保守的RNA结合蛋白（RBP），可以提高特殊mRNAs的稳定性，使其在组织中稳定表达。Lin28的结构保守，含有冷休克结构域（CSD）和一对反向的CCHC锌指结构域（ZFM）。Lin28可以通过抑制let-7来调节干细胞自我更新，Lin28/ let-7通路参与干细胞功能和肿瘤发生［12］。Sox2和Lin28的相互作用，除了能结合其他转录因子将体细胞重编程为iPSCs，共同维持干细胞特性之外，在神经细胞形成中也有作用。Sox2-Lin28/ let-7通路可以调节神经前体细胞的增殖和促进神经的形成［13］。

本研究发现，水牛Sox2和Lin28与其他物种Sox2和Lin28基因在基因序列和蛋白结构上具有高度的保守性，其中Sox2含有HMG box结构域、无内含子（只有一个外显子），Lin28含一个冷休克蛋白结构域和两个CCHC型锌指结构域。在克隆水牛Sox2的过程中，由于编码区GC含量偏高（66.36%），影响到PCR扩增效率，因此本研究PCR体系中采用GC buffer（Takara）可以获得目的片段。另外，在前期研究结果已经表明pMSCV载体系统携带EGFP（绿色荧光蛋白）所生产的病毒可以感染NIH3T3［14］。本研究使用MSCV骨架构建表达Sox2和Lin28的逆转录病毒载体，经过病毒包装后感染NIH3T3，并筛选出相应的阳性克隆细胞系。

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Cloning and Expression of Buffalo Transcription Factors Sox2 and Lin28

ZOU Ling-xiu，DENG Yan-fei*，CHEN Feng，QIAO Shu-ye，YANG Su-fang，SHI De-shun*
（College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Guangxi Nanning 530005，China）

Buffalo transcription factors Sox2 and Lin28 were cloned and expressing vectors were constructed.This investigation will provide a good foundation for researching the roles of two genes in pluripotent regulation of buffalo stem cells.The that RNA was extracted from fetus germ ridge，the coding sequences（CDS）of Sox2 and Lin28 were cloned by RT-PCR.The expression retroviral vectors pMSCV-Sox2 and pMSCV-Lin28 were constructed，and transfected into NIH3T3 cells with retrovirus infection，expression of Sox2 and Lin28 were detected by RT-PCR respectively.The results showed that the CDS length of Sox2 and Lin28 were 966 bp and 618bp respectively.The protein structure exhibited high conserved，amino acids sequence exhibited high homology with bovine，pig，human and mouse，the percentage of similarity were 96%，95%，94%，94%respectively for Sox2，and 98%，97%，89%，91%for Lin28. pMSCV retroviral vectors based Sox2 and Lin28 could expressed in the NIH3T3 cells respectively.

buffalo；transcription factors；cloning；eukaryotic expression

S823.2

：A

：0258-7033（2015）19-0059-04

2015-03-23；

2015-04-23

国家自然科学基金资助项目（31360287）；广西自然科学基金（2014GXNSFBA118074）；国家“863”重大专项（2011AA100607）；教育部博士点基金（20134501120003）

邹灵秀（1987-），女，重庆市人，硕士，主要从事动物免疫学和微生物学研究，E-mail：350882935@qq.com

*通讯作者：邓彦飞（1983-），男，博士，副教授，E-mail：yanfeidun@163.com；石德顺（1962-），研究员，博导，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn