奶牛孕酮单克隆抗体的制备及其鉴定

李兰，张洪友*，夏成，于永忠，魏玉华，高阳，钱伟东，牛聪（.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆6339；.黑龙江八一农垦大学生命技术学院，黑龙江大庆6339）

奶牛孕酮单克隆抗体的制备及其鉴定

李兰1，张洪友1*，夏成1，于永忠2，魏玉华2，高阳1，钱伟东1，牛聪1
（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学生命技术学院，黑龙江大庆163319）

国内外研究表明通过对奶牛血液及乳汁中孕酮水平的检测能有效的用于奶牛发情鉴定、妊娠诊断及繁殖障碍性疾病的监测。本研究旨在制备鼠抗孕酮单克隆抗体，为奶牛孕酮免疫学检测技术提供研究基础。实验采用碳化二亚胺方法合成孕酮完全抗原，经SDS-PAGE电泳及紫外分光光度计扫描鉴定，结果表明孕酮免疫抗原（P4-BSA）及检测抗原（P4-OVA）合成制备成功。乳化后的P4-BSA经皮下免疫小鼠，三免后血清效价可达到1∶64000。采用聚乙二醇化学融合方法进行细胞融合，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，最终获得一株能稳定分泌IgG1型抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，诱生的腹水经辛酸硫酸纯化制备，抗体的特异性较好。

孕酮；抗原制备；单克隆抗体；腹水

近年来，随着我国奶业持续健康发展，在奶牛产量提高的同时其繁殖能力却有所下降，因此对奶牛繁殖性能的检测及评估显得尤为重要［1］。目前，直肠触诊和超声检测仍是奶牛早期妊娠诊断的主要技术，而直肠触诊通常在人工授精2个月后才能确诊，同时直肠触诊也会对奶牛产生应激、对子宫会造成感染，而且对工作人员要求较高。有报道称，通过孕酮含量的测定可以监测动物的卵巢功能、妊娠和繁殖，减少空怀可以提高动物的繁殖率，增加其经济效益［2］。孕酮属于甾体类激素，主要由黄体和胎盘产生，肾上腺皮质、睾丸和排卵前的卵泡也能产生少量的孕酮。动物临床上多应用少量孕酮和雌激素共同发生作用对生殖系统进行调控，达到促进动物发情或治疗繁殖障碍性疾病的目的［3］。孕酮在体内主要调控生殖系统，尤其在母畜怀孕早期表现最明显，主要是为妊娠做准备，识别并维持妊娠。母畜一旦妊娠，体中孕酮含量会明显增加，为受精卵着床、胚胎发育创造条件。孕酮的含量直接反映黄体的活动。研究表明，奶牛在发情期、间情期时孕酮浓度多低于3 ng/mL，而在黄体及妊娠期奶牛乳中的孕酮可高达20 ng/mL［4-5］。本实验旨在制备孕酮单克隆抗体，为诊断试剂盒研制奠定基础，为奶牛发情鉴定和早期妊娠诊断提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂及实验动物孕酮-11α-半琥珀酸脂（11α-OH-P4-HS）购自Fitgerald公司，二甲基甲酰胺（DMF）、二环己基碳化二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）购自SIGMA公司。卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、透析袋购自鼎国生物公司，96孔可拆酶标反应板购自美国康宁公司。胎牛血清购自杭州四季青，50倍HAT和50倍HT均购自SIGMA公司。10只6～8周龄雄性BALB/c小鼠购自长春生物制品研究所实验动物中心。NanoDrop 2000/2000c紫外-可见分光光度计。

1.2 免疫抗原和检测抗原的制备与鉴定鉴于孕酮为小分子甾体类激素，不具有免疫原性。本研究采用碳化二亚胺方法将11α-OH-P4-HS分别偶联BSA和OVA制备免疫抗原和检测抗原制备［8-10］。取1 mg 11α-羟基孕酮半琥珀酸（11α-OH-P4-HS）溶解于0.02 mL二甲基甲酰胺（DMF）中；再分别取0.029 8 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和0.534 mg二环己基碳化二亚胺（DCC），各自溶于0.004 mL DMF中；将3种溶液混合，振荡90 min；将振荡均匀后的溶液缓慢逐滴加入2.1 mg OVA（溶于pH 7.0磷酸盐缓冲液（PB））用于制备P4-OVA或逐滴加入3.2 mg BSA（溶于pH 7.0磷酸盐缓冲液）用于制备P4-BSA，4℃搅拌过夜。对偶联的液体于PBS中透析15 h，期间换液3次，透析后的偶联物，4 000 r/min，离心30 min，取上清分装，在-20℃冻存备。偶联后的抗原分别经SDS-PAGE电泳鉴定及NanoDrop 2000/2000c紫外-可见分光光度计进行扫描分析。

1.3 动物免疫本研究选用P4-BSA为免疫抗原，对6～8周龄BALB/c小鼠进行免疫，首次免疫剂量50 μg与等体积的福氏完全佐剂进行乳化，颈背部皮下分点注射。首免21 d后进行加强免疫，50 μg P4-BSA与等体积的福氏不完全佐剂乳化后进行颈背部皮下免疫，间隔进行，第3次加强免疫10 d后断尾采血分离血清，间接ELISA检测抗孕酮多克隆抗体（pAb）效价，挑选效价高的小鼠为融合备用鼠。

1.4 细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选［11-12］融合前7 d复苏sp2/0细胞，经传代培养，选取细胞生长旺盛，边缘透亮，形态良好细胞用于融合。细胞融合前3 d对小鼠腹腔注射50 μg不加佐剂的P4-BSA进行加强免疫。融合前1 d，取一只未经免疫的BALB/c小鼠摘眼球采血，并拉颈处死，无菌操作取腹腔巨噬细胞制备含1%HAT饲养层细胞用于杂交瘤细胞培养。取加强免疫3 d后小鼠，无菌取出小鼠脾脏于无菌滤网上研磨，收集脾细胞并计数。将经过细胞计数后的脾细胞和Sp2/0细胞按5～6∶1的比例混合，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清进行细胞融合［7］。在37℃水浴条件下在1 min内向细胞内加入1 mL PEG1450，边加边摇使其与细胞混匀，静置90 s后，1640培养液终止融合反应，具体做法是第1 min加1 mL，第2 min加1 mL，第3 min加2 mL，边加边轻轻转动离心管，随后3 min内再加RPMI-1640不完全培养液21 mL。1 000 r/min离心8 min，弃上清，37℃预热的1%HAT选择培养液轻悬细胞沉淀，以100 μL/孔滴加到含有饲养层细胞的96孔培养板中，于37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。

1.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选细胞融合第6天时用HAT培养液对细胞进行半换液，第11天时抽取细胞上清用间接ELISA方法进行阳性细胞株的筛选，将阳性孔细胞转至24孔板中培养，7 d后抽取上清再次用间接ELISA方法筛选。阳性孔细胞进行有限稀释克隆化，细胞计数后用含有HT的培养液稀释后滴加到96孔板中培养，使每孔中含有1～1.5个细胞。7 d后抽取细胞上清进行筛选克隆（直到96孔板中克隆的细胞全部成阳性细胞），扩大培养后将其冻存一部分，其余的继续培养制备腹水。

1.6 阳性孔特异性鉴定筛选出的细胞上清与OVA、BSA、P4-OVA进行间接竞争ELISA实验。

1.7 腹水制备及其纯化采用体内诱生腹水法制备腹水。选择产过幼仔的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1 mL石蜡，一周后，将杂交瘤细胞按2×105～6× 105注入小鼠腹腔诱生腹水，7～10 d后收集腹水。采用鼠源McA b亚类鉴定试剂盒对腹水进行IgG亚类鉴定。采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对腹水进行初步纯化。收集腹水12 000 r/min离心15 min，去除杂质。1份腹水与2份醋酸盐缓冲液混合，室温搅拌后按稀释前1 mL再加33 μL/mL正辛酸。室温混合30 min后4℃初静置2 h，之后再4℃10 000 r/min离心50min，弃沉淀取上清。将pH值调至7.4。然后加等体积的饱和硫酸铵充分混匀4℃过夜，次日4℃10 000 r/min离心30 min弃上清，用PBS冲悬沉淀。4℃透析过夜。纯后的腹水进行Western blot鉴定。

2 结果

制备的完全抗原经紫外-可见分光光度计分析，结果见图1。载体蛋白BSA在278 nm波长处出现强吸收峰，半抗原11α-OH-P4-HS最大吸收波长为248 nm。偶联的免疫抗原P4-BSA紫外吸收曲线与半抗原和载体蛋白的紫外吸收曲线图形和趋势都不同，同时从图3可以看出偶联物经SDS-PAGE电泳结果显示P4-BSA略大于BSA，由此可说明偶联反应后，载体蛋白的分子量略有增加，证明偶联成功。

图1 P4-BSA的紫外扫描谱图

图2同图1一样，偶联的紫外吸收曲线与半抗原和载体蛋白的紫外吸收曲线图形和趋势都不同，图3 SDS-PAGE电泳鉴定结果也显示P4-OVA略大于OVA，证明偶联成功。

图2 P4-OVA的紫外扫描谱图

图3 偶联物SDS-PAGE电泳图

2.2 间接ELISA检测方法的建立抗原和抗体经稀释后进行ELISA检测，结果如表1所示。在抗原以1：800稀释，阴性血清和阳性血清以1∶1 000稀释时，P/ N值最大，为12.95。OD450mm值接近1。因此确定抗原以1∶800稀释包被酶标板，且血清以1∶1 000稀释作为对照间接ELISA检测方法的最佳工作条件。

2.3 杂交瘤细胞株筛选间接ELISA方法测定第3次免疫10 d后小鼠血清效价可达1：64 000（见表1），选择免疫效果较好的小鼠腹腔注射P4-PBS加强免疫。采用聚乙二醇化学融合方法进行细胞融合，共筛选出2株阳性杂交瘤细胞株（1F11和2B6）。其中2B6随着扩大培养和克隆筛选细胞状态逐渐变差。1F11细胞株直到第4次克隆仍具有稳定的阳性值。

表1 小鼠第3次免疫检测效价结果

2.2.4 细胞株特异性的鉴及亚类鉴定间接ELISA法测定1F11细胞株上清液与OVA和BSA交叉反应结果（见表2），当OVA和BSA包被酶标后，间接ELISA法测定结果P/N值均小于2.1，为阴性反应，表明筛选出的杂交瘤细胞株与OVA和BSA均无交叉反应。扩大培养后的1F11细胞株注入小鼠腹腔诱生腹水，腹水经鼠源McAb亚类鉴定试剂盒分析结果显示1F11为IgG1亚类（表3）。

表2 单克隆抗体特异性检测结果

表3 单克隆抗体亚类鉴定结果

2.2.4 抗体特异性鉴定P4-BSA和BSA蛋白经SDS-PAGE后，腹水初步纯化后为一抗，DAB显色后，P4-BSA在67～70 ku出现清晰条带，BSA处无条带，结果表明抗体识别P4-BSA蛋白。

图4 单克隆抗体的Western blot鉴定

3 讨论

正常免疫小鼠如果没有特殊要求一般选用雌性Balb/c小鼠，但本实验为了减少雌性小鼠自身孕酮影响，故改用雄性小鼠。鉴于孕酮为小分子抗原，本研究利用碳化二亚胺方法制备了孕酮完全抗原。鉴定完全抗原是否偶联成功常用SDS-PAGE和紫外光谱扫描。将半抗原连接到载体蛋白上经UV扫描，吸收强度会发生变化。SDS-PAGE能定性判断半抗原是否偶连到载体蛋白上［13］。本实验经2种方法鉴定结果表明完全抗原合成成功。对于小分子抗体的制备，建议免疫程序最好选择大剂量长期免疫，能够获得较好的免疫效果。本实验融合阳性率不高，可能与操作手法不娴熟、试验器材选择有关，融合细胞建议选择进口血清。虽然杂交瘤细胞融合技术业已成熟，但仍有多方面因素像细胞的融合率，但本研究发现融合过程中操作程序的规范性、操作手法娴熟度、实验材料质量的差别都会影响到细胞的融合率。本实验经3次融合及有限稀释亚克隆获得阳性率较好的杂交瘤细胞株1株，对于克隆后的细胞选择生长良好进行冻存，避免细胞污染丢失细胞株。辛酸硫酸铵法主要用于IgG2b和IgG1的纯化，对于IgGA和IgG3的纯化效果并不好［14］。本实验抗体亚类鉴定为IgG1，粗纯化后的腹水效价可达到1.02×106，Protein G纯化试剂盒纯化的抗体应该具有制备检测孕酮试剂盒的特性，孕酮单克隆抗体的制备为检测乳牛体中孕酮含量奠定一定的基础。本研究在其诊断方面有了进一步的提高。

4 结论

综上所述，应用碳化二亚胺将半抗原和OVA、BSA偶联，并经紫外分光光度计扫描和SDA-PAGE鉴定偶联成功。将抗原免疫小鼠，小鼠效价达到1∶64 000，经进行细胞融合获得了1株稳定分泌抗孕酮的细胞株，命名为1F11。McAb亚类为IgG1型，具有良好的特异性。

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S823

：A

：0258-7033（2015）19-0063-04

2014-12-13；

2015-02-23

黑龙江省科技攻关项目（GC0313708）；国家科技部项目（2013BAD21B01-2）；黑龙江省人才项目（1252-NCET-003）

李兰（1988-），女，黑龙江萝北县人，在读研究生，E-mail：253822337@qq.com

*通讯作者：张洪友，男，教授，硕士研究生导师，兽医临床内科学，E-mail：zhy478@163.com