银杏叶复方对免疫抑制小鼠细胞因子和肝脾组织形态的影响

李焰，邓心慰，曾福炎，王华，2，尹会方，2（.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364000；2.预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建龙岩364000）

银杏叶复方对免疫抑制小鼠细胞因子和肝脾组织形态的影响

李焰1，2*，邓心慰1，曾福炎1，王华1，2，尹会方1，2
（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364000；2.预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建龙岩364000）

本试验旨在研究银杏叶复方（YXF）和四君子汤（SJZ）对环磷酰胺（CY）所致免疫抑制模型小鼠细胞因子和肝脾组织形态的影响。KM种小鼠180只，雌性，随机分为6组，每组6个重复，每个重复5只。A为对照组（CK），B为CY组，C为YXF组，D为CY+YXF组，E为SJZ组；F为CY+SJZ组。A、B和C、D、E、F组分别每天灌服蒸馏水和相应制剂0.3 mL/只，A、C、E和B、D、F组分别按照75 mg/kg体重隔日腹腔注射生理盐水和CY，连续15 d。结果表明：CY组的IL-1、TNF-a含量较CK组显著下降（P＜0.05），CY+YXF组的IL-1和TNF-a含量较CY组有所增加（P＞0.05）；CY+SJZ组TNF-a含量较CY组有所降低（P＞0.05）。CY组的肝细胞出现空泡样变性，CY和CY+SJZ组脾脏红白髓界限不明显；CY+YXF组肝细胞板完整，白髓大而明显；CY+SJZ组肝细胞形态结构基本正常。结论，YXF制剂通过调控细胞因子生成，对CY介导的免疫抑制小鼠的细胞免疫发挥正向调节作用，拮抗CY对肝脾组织造成的损伤，效果优于SJZ。

银杏叶复方；免疫抑制小鼠；细胞因子；病理变化

目前在养殖过程中由于化药、抗生素的盲目滥用和严重超标，导致畜禽适应能力和抗病能力下降，也造成多病原疫病流行，由此发生的食品安全问题屡见不鲜。中药则在协调机体平衡，增强机体抗病能力方面具有独特疗效［1］，将中医理论应用于动物身上，将“治未病”作为动物保健的前提，能够减少疫苗、化学药物及抗生素的使用。中医认为“四季脾旺不受邪”，脾失健运，气血生化能力下降，表现为免疫功能的低下。许多研究表明，脾虚动物均有明显的免疫功能低下，其中又以细胞介导的免疫功能所受影响更明显［2］。前期研究发现，脾虚小鼠存在神经-内分泌-免疫网络之间的调节失衡，最终引起脾虚时的机体免疫功能低下，经银杏叶复方治疗后上述免疫失调得到明显纠正［3］；银杏叶复方的急性毒性、最大耐受量及细胞毒性研究表明该方剂毒性很小，临床使用安全［4］；饲粮中添加适量的银杏叶复方制剂，可维持和养护断奶肉兔的小肠黏膜组织［5］。为进一步探讨银杏叶复方对免疫功能的调节作用，本研究根据中药方剂的组方原则，以具有免疫调节作用的四君子汤为对照，观察了银杏叶复方对CY所致免疫抑制模型小鼠细胞因子和肝脾组织形态的影响，为组方优化以及用于动物养殖实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料环磷酰胺（Cy）（0.2 g/支），江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：10030921。每支Cy用10 mL生理盐水溶解，以75 mg/kg的剂量进行腹腔注射。

四君子汤为以3∶3∶3∶1配比的党参、白术、茯苓、炙甘草，选自《太平惠民和剂局方》。

银杏叶复方制剂包括银杏叶、黄芪、党参、白术、茯苓、砂仁、陈皮。银杏叶粉购自长沙博键生物科技有限公司，产品标准号：Q/ADPG001-2008；其余药物均购自龙岩市第一医院，质量符合中华人民共和国兽药典标准。

以上2种方剂按比例配比，采用传统水煎法：蒸馏水预行浸泡2 h，加热煎煮2次，第1次保持微沸30 min，滤出药液；药渣加温水再煮沸，仍保持微沸30 min，滤出药液；合并2次滤液，小火浓缩至1 g/mL（按照生药量计算）。

1.2 试验动物6周龄清洁级KM种小鼠，雌性，体质量25～30 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号2007000564825。

1.3 免疫抑制小鼠模型的建立选用细胞毒化疗药物—CY制作免疫抑制模型，临床研究表明CY也是一种免疫抑制剂，使小鼠细胞免疫功能受到明显的抑制，可建立长期免疫低下模型［6］。经预试验以小鼠精神沉郁、怕冷、扎堆，体重显著减轻表示模型制作成功，CY的使用剂量为每支Cy用10 mL生理盐水溶解，以75 mg/kg的剂量进行腹腔注射。

1.4 动物分组与处理KM种小鼠180只，随机分为6组，每组6个重复，每个重复5只小鼠。试验设计及分组见表1。各组灌服蒸馏水和相应制剂的剂量为0.3 mL/只，每天1次；生理盐水和CY的剂量按照75 mg/kg体重腹腔注射，隔日一次。连续15 d。

表1 试验设计及分组

1.5 血清中细胞因子含量的测定末次给药各组小鼠禁食不禁水，12h后眼眶采血1mL，离心（3500r/min） 15 min，取血清，放入EP管，-70℃保存。采用放射免疫方法检测白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。试剂盒均由北京华英生物技术研究所提供，严格按照试剂盒说明操作。

1.6 切片的制作和观察将采血后小鼠的肝和脾用体积分数10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，常规方法制备切片并HE染色，光镜下进行组织病理学检查。

1.7 统计分析应用统计软件SPSS 16.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan′s多重比较，所有数据用均值±标准差表示。

2 结果

2.1 银杏叶复方制剂对免疫抑制小鼠血清中细胞因子IL-1、IL-6和TNF-a含量的影响由表2可见，CY组的IL-1含量较CK组显著下降（P＜0.05），YXF组与SJZ组IL-1的含量较CK组显著增加（P＜0.05），CY+ YXF组IL-1的含量较CY组有所增加但差异不显著（P＞0.05）；CY+SJZ组IL-1的含量较CY组显著提高（P＜0.05），与CY+YXF组含量相比差异不显著（P＞0.05）；CY组IL-6的含量与其他各试验组相比差异不显著（P＞0.05）；CY组TNF-α含量较CK组显著下降（P＜0.05），YXF组与CY+YXF组TNF-α含量较CY组有所增加，但差异不显著（P＞0.05），SJZ组和CY+SJZ组TNF-α含量较CY组有所降低，但差异不显著（P＞0.05）。

表2 银杏叶复方制剂对免疫抑制小鼠血清中细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的影响ng·mL-1

2.2 银杏叶复方对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠肝脾组织形态的影响经采血后的小鼠进行处死解剖取肝脏、脾脏，可明显观察到凡注射过CY的小鼠，脾脏均有不同程度的萎缩，肝脏及其他脏器未见明显肉眼可见病变。对肝和脾进行组织病理学检查可见，CK组和YXF组小鼠肝细胞板完整，排列规则，细胞膜形态完整，无炎性细胞浸润，细胞核大而深染，位于细胞中央（分别见图A1、C1），脾组织中的白髓大而明显（分别见图A2、C2）；CY组的肝出现肿胀现象，肝细胞核浓染（核浓缩），有的细胞核已消失，部分肝细胞出现空泡样变性，可见坏死的肝细胞（图B1），脾脏红白髓界限不明显，结构杂乱，脾小梁密集（图B2）；相对于CY组，CY+YXF组小鼠肝细胞板完整，排列规则，细胞核大而深染，胞质染色均匀，肝组织未见明显病变（图D1），脾组织中的白髓大而明显（图D2）；SJZ组肝脏细胞个别出现核浓缩甚至核消失（见E1），脾脏白髓小（见E2）；CY+SJZ组肝细胞的肿胀现象减轻，少见肝细胞坏死和空泡样变性，肝细胞形态结构基本正常（F1），脾脏红白髓界限不明显，脾小梁密集（图F2）。以上结果表明，银杏叶复方能有效拮抗CY对肝脾组织造成的损伤，效果优于四君子汤。

图1 小鼠肝脏病理组织学观察（HE染色，400×）

图2 小鼠脾脏病理组织学观察（HE染色，40×）

3 讨论

CY是一种细胞毒性药物，同时也属于烷化剂类免疫抑制剂，作为一种化疗药物，因具有明显的杀伤肿瘤作用，在肿瘤治疗中被广泛应用。其作用主要是破坏DNA的结构，它能杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞，具有较强的免疫抑制作用，故在免疫学研究中，常以CY作为细胞免疫、体液免疫中的免疫抑制模型的制备药物［7-9］。临床实践证明，在拮抗化疗损伤方面，中医药有独特优势，具有扶正祛邪的复方制剂目前被广泛应用于临床。如韩春杨等［10］研究发现，自拟中药免疫调节剂对免疫抑制小鼠血细胞数、体质量、脾脏指数以及脾、肝组织病理学均表现出一定的正向调节作用；吴军等［11］研究了四君子汤、六味地黄汤对CY致小鼠免疫抑制的拮抗作用，结果表明CY能明显降低小鼠脾指数，抑制胸腺细胞增殖，诱导脾细胞凋亡，而四君子汤和六味地黄汤能显著提高脾指数，促进胸腺细胞增殖及抑制脾细胞凋亡。本试验中免疫抑制组小鼠的血清中Th1型细胞因子，如TNF-α和IL-1较对照组显著降低，而Th2型细胞因子IL-6含量与对照组无显著性差异，Th1/Th2细胞比例失调，可能的作用机制是由CY导致了机体免疫功能的失调，详细机制有待于进一步研究。

试验采用CY制作小鼠的免疫抑制模型，显示其对机体免疫功能的损伤是多方面的。从细胞因子角度分析，CY阻抑了多种细胞因子（IL-1、IL-6和TNF-α）的产生；从形态学角度分析，CY则引起小鼠肝脏和脾脏细胞的病理学变化，银杏叶复方制剂对通过调控细胞因子生成，对CY介导免疫抑制模型小鼠的细胞免疫发挥着正向调节作用，能有效拮抗CY对肝脾组织造成的损伤，这种作用与银杏叶复方组成有关。中医理论中肝为刚脏，其性疏泄调达，有赖于脾生化之水谷精微濡养，才能刚柔相济，体阴而用阳，则称为“脾土营肝木”。若脾失健运，水湿停聚，壅塞气机，反侮肝木，致肝失疏泄，即“土壅侮木”［12］，方中，银杏叶味甘、苦、涩，性平，归心、肺经，具有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效［13］。现代药理学研究表明，银杏叶所含化学成分相当复杂，包括黄酮类、萜类、生物碱、多糖、酚类及氨基酸等。其中黄酮类和萜内酯是银杏叶中发挥独特药理活性的有效成分，而且是银杏叶及其中间品和植物药制剂质量标准化的重要依据［14］。近年研究发现，其药理作用范围不断扩大，特别是具有促进毛细血管循环以及营养脾胃和心脑脏器功能的作用［15］。黄芪、党参为补气健脾、益血首选药物，三药合用具有补气健脾、提升脾胃消化功能之功效，是为君药，白术补气健脾，燥湿利水，协助君药以健脾化湿，使脾胃功能更旺，为臣药。茯苓利水渗湿、健脾为佐，砂仁、陈皮化湿行气，调中是为使药。中药五行理论认为心属火，脾属土，而火又生土，故银杏叶有利脾之功效，诸药合用共奏补气健脾、营养脏器、行气化湿之功效，脾胃功能旺盛，营养充足则免疫力增强。

4 结论

银杏叶复方制剂通过调控细胞因子生成，对环磷酰胺介导免疫抑制模型小鼠的细胞免疫发挥正向调节作用，能有效拮抗CY对肝脾组织造成的损伤，效果优于四君子汤。

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Effect of Ginkgo Biloba Compound on Cytokines and Histomorphology of Liver and Spleen in Immunosuppressive Mice

LI Yan1，2*，DENG Xin-wei1，ZENG Fu-yan1，WANG Hua1，2，YIN Hui-fang1，2
（1.Collge of Life Science，Longyan University，Fujian Longyan 364000，China；2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology，Fujian Longyan 364000，China）

This experiment was conducted to study the Ginkgo biloba compound on cytokines and histomorphology of liver and spleen in the cyclophosphamide（CY）induced immunosuppression mice.A total of 180 female，KM mice were divided randomly into 6 groups with，six replicates and five in each.Group A was control group with normal mice（CK）.Group B was cyclophosphamide induced mice（CY）.Group C was normal mice fed with Ginkgo biloba compound as the therapeutic drug（YXF）.Group D was cyclophosphamide induced mice fed with Ginkgo biloba compound as the therapeutic drug（CY+YXF）.The last two groups were E（SJZ）and F（CY+SJZ），which were both administered by Sijunzi decoction and consisted of normal mice and cyclophosphamide induced mice respectively.Group A and B were administered with 0.3 mL distilled water everyday，while group C/D and group E/F were injected Ginkgo biloba compound and Sijunzi decoction as the same volume.The results showed that The content of IL-1，TNF-α was decreased significantly（P＜0.05）in group CY when compared with group CK.The contents of IL-1，TNF-α in group D（CY+YXF）were increased（P＞0.05）when compared with group CY.The level of TNF-α in group F（CY+SJZ）was lower than group CY（P＞0.05）.Moreover，hepatic vacuolar degeneration was found and red pulp's boundary in spleen was not clear in group CY，while the hepatic cell were aligned and integrated and the white pulp in spleen tissue was clear in group CY+YXF.In group CY+SJZ，the liver swelling was reduced and hepatic cell vacuoles degeneration was rarely happened.But the red and white pulp line in spleen was not obvious.The result indicatedthat the Ginkgo biloba compound could effectively inhibit CY induced damage of liver and spleen by generating regulatory cytokines and enhancing function of the immune cell in immunosuppression model mice.Furthermore，the therapeutic effect of Ginkgo biloba compound was better than Sijunzi decoction.

compound of Ginkgo biloba；immunosuppressive mice；cytokine；pathologic changes

S865.5

：A

：0258-7033（2015）19-0071-04

2015-02-11；

2015-05-07

国家自然科学基金面上项目（31470129）；龙岩市科技局项目（2014LY24）；福建省自然科学基金项目（2012J01142）

李焰（1968-），女，四川安县人，硕士，教授，主要从事饲料添加剂研究，E-mail：529783204@qq.com

*通讯作者