几种绿肥的根系分泌物对土壤锌的活化效应

李欣雨，刘函亦，薛少琪，邢莉彬，彭亚茹，蒙元永，杨 瑜，黄冬琳

（西北农林科技大学资源环境学院/农业农村部西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西 杨凌 712100）

锌是人体所需的微量元素，对人体健康起着至关重要的作用，我国大约有一亿人锌摄入量不足［1-2］。作物中锌含量低主要受到土壤锌缺乏的制约［3］，黄土高原石灰性土壤全锌含量平均为69.1 mg/kg，然而，超过一半面积以上的土壤有效锌含量低于临界值0.5 mg/kg。因此，该区域作物缺锌的主要原因是土壤中可供吸收利用的有效锌较少，而并非土壤中锌含量低［4-6］。石灰性土壤制约锌有效性的因素主要为高pH值、高碳酸盐含量、土壤有机质低和土壤水分缺乏［3］，其中土壤pH值对锌的有效性影响最为显著［7］。为解决土壤缺锌问题，施用锌肥是最为经济、有效且易被接受的途径［8-9］。我国石灰性土壤的锌肥试验表明锌肥有效利用率不足1%，大部分锌肥进入土壤都转为无效的矿物态［10-13］，还存在潜在的环境风险。绿肥作为养分丰富的全能型肥，被纳入我国农田种植体系，能够培肥土壤，提高土壤锌等微量矿物营养的供应［14-15］。

田间及盆栽试验研究发现不同绿肥在提高石灰性土壤中有效锌含量的同时，也可以有效增加后茬小麦锌的含量［16-17］。黄土高原低锌旱地研究发现，绿豆、怀豆和大豆3种绿肥与小麦轮作均可显著提高小麦籽粒锌含量，增幅为7.1%～28.6%［18］。不同绿肥对土壤锌的活化能力及提高后茬小麦籽粒锌含量的幅度与其自身吸收累积锌呈正相关。绿肥将自身累积锌通过翻压还田、输入土壤显著增加土壤溶解性有机碳（DOC）含量，绿肥收获期黑麦豆处理使土壤DOC含量提高了17.0%，土壤有效锌含量显著增加，且显著高于其他处理［19-20］，因此，绿肥自身锌吸收能力是其活化土壤锌、提高后茬作物锌含量的关键。不同或同一作物的不同品种吸收、富集环境介质中锌的能力有很大差异，如青菜中，品种五月慢地上部的吸锌量显著高于品种黑油白菜，是后者的1.3倍［21］，大麦、油菜、青菜等作物也存在相似的现象［21-23］。植物生长过程中其根系向生长环境分泌大量无机离子和有机化合物来改善根际环境［24］。养分胁迫时，根系分泌物的成分和含量会发生变化以适应环境的改变。如植物缺锌时，根系会分泌出大量无机离子和有机酸等低分子化合物［25］，其中低分子有机酸主要包括苹果酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、甲酸、乙酸等［26］，由于含有大量羧基，且羧基是很好的阳离子交换基团，可以通过酸化、还原及配位交换等作用溶解和转化一些难溶性矿物，增加Fe、Mn、Cu、Zn等营养元素在土壤中的可溶性和移动性，提高土壤锌养分的有效性，促进植物吸收利用［21，27-31］。但由于它们携带不同的酚羟基和羧基功能团，对土壤矿质元素的活化存在一定的差异性，不同有机酸对土壤重金属的活化能力不同［32-33］。

田间试验研究发现不同绿肥对后茬小麦锌含量的提高幅度不同，并与绿肥自身锌吸收量成正比［20］。绿肥利用土壤锌能力存在的差异，是否与其根系分泌物有机酸成分及分泌量有关？根系分泌的有机酸在活化土壤锌能力上是否存在差异？本研究将对绿肥根系分泌物进行分析鉴定，探明不同绿肥根系分泌有机酸在组成和数量上的差异，并通过比较不同有机酸对土壤锌的浸提效果，以期深化不同绿肥对土壤锌活化效应，为通过绿肥活化土壤锌的生物强锌手段提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 不同绿肥吸锌量差异的比较

1.1.1 试验区概况及试验设计

田间试验位于陕西省咸阳市永寿县御驾宫乡御中村（34°43′N、108°11′E），旱地雨养农业区，主要耕作制度为一年一熟，夏闲期为7～9月。田间试验开始于2015年6月，本研究的时间为2017年7～8月。绿肥生长期为7月初到8月底，绿肥盛花期收获后种植小麦。年平均温度10.5℃，无霜期210 d，平均年降水量530 mm。

田间试验为裂区设计：主区处理为3种不同的绿肥，分别为黑麦豆、绿豆、高丹草。副区处理为施锌（ZnSO4·H2O 15 kg/hm2）和不施锌两个处理，4次重复。土壤类型为黑垆土，试验开始时0～20 cm土壤有机质含量12.92 g/kg，全氮含量0.82 g/kg，硝态氮含量11.9 mg/kg，铵态氮含量4.57 mg/kg，有效磷含量11.2 mg/kg，速效钾含量113.5 mg/kg，pH值8.4。施锌和不施锌处理DTPA-Zn含量分别为1.74和0.38 mg/kg。

1.1.2 样品采集与测定

每个小区随机采集30株绿肥（翻压前）作为分析样品。取部分样品用去离子水清洗后90℃杀青30 min，65℃烘至恒重，用氧化锆球磨仪（莱驰MM400，德国）磨细，备用。粉碎的植物样品用HNO3-H2O2微波消解仪（安东帕MWPro）消解，原子荧光光谱法（日立Z2000）测定绿肥各器官锌含量。

1.2 绿肥根系分泌物有机酸的分离与测定

1.2.1 试验材料与试剂

供试作物：黑麦豆（品种为永寿县当地品种）、绿豆（品种为横山绿豆）、高丹草（品种为百宝饲）。有机酸标品：草酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸，均购自百灵威科技，纯度为99%。流动相试剂：乙腈、磷酸氢二铵，均为色谱纯。

1.2.2 水培试验

培养液成分：4 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O、6mmol/L KNO3、1 mmol/L （NH4）2HPO4、0.6 mmol/L MgSO4·7H2O、46 μmol/L H3BO3、9 μmol/L MnCl2·4H2O、0.3 μmol/L CuSO4·5H2O、0.7 μmol/L MoO3、50 μmol/L Fe-EDTA。

试验设2个锌营养水平Zn0、+Zn（0.5 μmol/L ZnSO4·7H2O），重复3次。

选取籽粒饱满且大小一致的绿肥种子，20%H2O2消毒5 min，用蒸馏水冲洗干净后浸泡4 h，将种子散放在已灭菌且底部放有湿润滤纸的培养皿上，在20～25℃的培养箱中避光催芽，当子叶露出时照光培养。当根长至5～8 cm时，取生长状况均一的幼苗，移栽到营养液进行培养，加蒸馏水保持营养液体积不变。营养液最初浓度为正常浓度的1/2。每盆定植4株，盆的容积为1 L，采用小型通气泵连续通气。5 d后换成正常浓度进行培养，营养液pH值为6.30±0.01，之后每5 d更换一次营养液。严格控制人工气候室条件，昼/夜温度为25/20℃，相对湿度为65%～75%。

1.2.3 根系分泌物的收集与分离

分别将培养10和20 d的黑麦豆、绿豆和高丹草幼苗，用蒸馏水冲洗干净，将其放入盛有200mL蒸馏水的250 mL三角瓶中并加入3 滴0.05%（体积分数）的百里酚溶液，用铝箔纸包裹三角瓶遮光。在人工气候室光照收集12 h后，收集液用0.45 μm微孔滤膜抽滤，冷冻干燥机冻干，用超纯水定容至1 mL，-20℃下保存［34］。由于绿肥之间存在生物量差异，本研究引入单位生物量植物根干重的分泌量作为绿肥分泌量的评价指标。

1.2.4 有机酸的测定

用总有机碳分析仪（TOC-VCPH岛津，日本）测定DOC含量，超高效液相色谱仪（LC-30A岛津，日本）测定有机酸。有机酸标品在213 nm处均有较大且稳定的吸收峰，故确定检测波长为213 nm。磷酸盐缓冲液是最典型的洗脱液，可作为有机酸测定的流动相［35］。试验表明，流动相为NH4H2PO4（0.01 mol/L，pH 2.9）∶乙腈=98∶2时，峰形尖锐并可以有效地进行分离。当柱温为40℃且流速为0.5 mL/min时，有机酸分离效果较好，如图1。本试验对C5以下的低分子量有机酸进行了检测，分别为草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、甲酸、乙酸、乳酸和富马酸共9种有机酸，绿肥根系分泌物中检测到的低分子量有机酸仅4种，即草酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸，其他均低于检测范围。

图1 有机酸标准品色谱图

称取草酸0.01 g、柠檬酸0.05 g、琥珀酸0.1 g和富马酸0.01 g，用超纯水定容至100 mL，即为混标原液。将原液分别进行2、4、10、20、50、100、200、500倍稀释，进样5 μL，按照色谱条件进行分析，并以有机酸的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。4种有机酸的线性回归方程、决定系数R2、保留时间、线性范围以及相对标准偏差（RSD）见表1，4种有机酸回归方程的决定系数均能达到0.9999以上，这说明采用标准曲线法来计算该试验中有机酸的浓度具有较高的可行性［36］；5次平行进样后测得标样酸含量的相对标准偏差为0.53%～1.94%，说明该方法重现性较好，对绿肥根系分泌物中有机酸含量的测定具有稳定性和可靠性［35］。

表1 4种有机酸的标准曲线

1.3 有机酸对土壤锌的浸提

供试土壤为2017年绿肥播前永寿县绿肥-小麦轮作田间试验施锌小区0～20 cm土壤，采回的土样经自然风干，除去杂质，过2 mm筛后备用。以液土比10∶1添加各有机酸草酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸，均设6个浓度处理：0、0.3、0.6、1.2、1.8、3.0 mmol/L，称取风干土3 g加入100 mL离心管中，并加入30 mL有机酸浸提液（0.01 mol/L CaCl2，3滴0.1%百里酚），在往复振荡器上振荡24 h，20℃，振荡完毕后立即测定土壤pH值；以4500 rpm离心10 min，取上清液过滤后在火焰原子吸收光谱仪（PinAAcile900F美国PE，美国）上测定溶液中Zn含量，重复3次［37］。

2 结果与分析

2.1 不同绿肥地上部锌含量的差异

田间试验结果表明，绿肥种类及施锌水平均显著影响绿肥地上部的锌含量（图2）。未施锌处理下，黑麦豆地上部锌含量最高，为25.17 mg/kg，显著高于高丹草，绿豆锌含量与高丹草之间无显著差异。施锌条件下，黑麦豆地上部锌含量显著高于绿豆和高丹草，分别高了34.73%和26.30%。施锌显著提高了绿肥地上部的锌含量，且黑麦豆锌含量的增加幅度高于其他两种绿肥。

图2 不同绿肥地上部的锌含量

2.2 绿肥根系溶解性有机碳与总有机酸分泌量

溶解性有机碳反映了根系分泌总有机化合物的含量。水培试验结果（图3）表明，两个供锌水平下，3种绿肥溶解性有机碳分泌量之间无显著差异。+Zn处理绿肥根系分泌溶解性有机碳含量相比于Zn0处理均显著增加，其中黑麦豆、绿豆和高丹草较Zn0分别增加了59.07%、74.05%和37.12%。绿肥根系总有机酸分泌量与溶解性有机碳分泌量的趋势类似，+Zn处理绿肥根系总有机酸分泌量显著高于Zn0处理，其中黑麦豆、绿豆和高丹草较Zn0处理分别增加了66.04%、59.15%和49.46%。Zn0处理下，3种绿肥根系总有机酸分泌量之间无显著差异；+Zn处理下，黑麦豆与其他两种绿肥根系总有机酸分泌量之间存在显著差异，其分别是绿豆和高丹草的1.24和1.34倍。

图3 不同绿肥根系溶解性有机碳及总有机酸分泌量

总有机酸与溶解性有机碳分泌量的比值反映了绿肥在特定条件下根系分泌有机酸的相对能力。由图4可知，该比值为5.95%～7.64%，Zn0处理下，黑麦豆根系总有机酸与溶解性有机碳分泌量的比值最高，高丹草最低；+Zn处理下，3种绿肥根系总有机酸与溶解性有机碳分泌量的比值之间无显著差异；且黑麦豆和绿豆在两个施锌水平之间也无显著差异。

图4 绿肥根系分泌总有机酸与溶解性有机碳分泌量的比值

2.3 不同绿肥根系分泌主要有机酸的差异

不同绿肥根系分泌的主要有机酸之间存在较大的差异性。由表2和图5可知，黑麦豆根系分泌物中草酸、柠檬酸和琥珀酸3种有机酸的分泌量约占其总有机酸分泌量的99.7%，其中琥珀酸的分泌量显著高于其他两种绿肥。草酸为绿豆根系分泌物中的优势酸，其分泌量约占绿豆总有机酸分泌量的96.9%，草酸的分泌量显著高于其他两种绿肥。高丹草根系分泌的有机酸中草酸和琥珀酸约占其总有机酸分泌量的90.9%。从各有机酸的比例上看，3种绿肥根系分泌物的有机酸主要为草酸，草酸的分泌量为1181.3～5292.4 μg/g（根干重）。3种绿肥根系草酸的分泌量均占其总有机酸量的50%以上；而根系富马酸的分泌量较低，为2.8～22.6 μg/g（根干重），均不超过总有机酸分泌量的0.5%（表3）。

表2 不同绿肥根系有机酸分泌量的差异（μg/g 根干重）

图5 绿肥根系有机酸分泌量的比例

表3 供锌状况对绿肥根系有机酸分泌量的影响（μg/g 根干重）

2.4 生长期及不同供锌水平绿肥根系分泌主要有机酸的差异

随着绿肥生长时期的推移，其根系有机酸的分泌量呈增长趋势（表3）。+Zn处理下，黑麦豆、高丹草根系草酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸的分泌量均呈现增长的趋势，分别增加了4.1%、47.2%、405.6%、76.6%和34.8%、64.9%、86.0%、35.7%。Zn0处理下，高丹草根系草酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸的分泌量也均呈现增长的趋势，分别增加了39.3%、73.7%、114.0%和284.7%；而黑麦豆根系柠檬酸、富马酸和琥珀酸的分泌量则呈降低的趋势，分别降低了93.6%、33.3%和41.8%

比较不同供锌水平（表3），+Zn处理多数绿肥根系有机酸分泌量高于Zn0处理。3种绿肥在+Zn处理下草酸、琥珀酸分泌量均高于Zn0处理，仅柠檬酸的分泌量与之呈相反趋势。Zn0处理下高丹草根系柠檬酸、富马酸的分泌量显著高于+Zn处理，高丹草根系通过有机酸分泌能力的增强来响应低锌胁迫。与Zn0处理相比，+Zn处理黑麦豆根系有机酸分泌量成倍增加，如水培20 d，+Zn处理下黑麦豆柠檬酸、琥珀酸、富马酸的分泌量显著高于其他两种绿肥，其分泌量分别是绿豆和高丹草的36.7、887.3、4.0和4.8、8.4、5.9倍。

2.5 不同根系分泌物有机酸对土壤pH值及土壤锌浸提能力的影响

土壤pH值与有机酸浸提液浓度的增加呈负相关关系（图6 a），随着有机酸浸提液浓度的增加，4种有机酸土壤浸提剂的pH值均呈下降趋势，且不同有机酸浸提剂对pH值降低的幅度（拟合方程的斜率）不同，其中草酸降低pH值的能力最强，琥珀酸次之，柠檬酸和富马酸最低。当4种有机酸浸提剂浓度为3 mmol/L，草酸、琥珀酸、富马酸和柠檬酸浸提剂的pH值分别下降约0.58、0.39、0.23和0.18个单位，最终4种有机酸浸提剂的pH值稳定在7.3～7.5。

4种有机酸浸提液对土壤锌都有较强的溶出能力（图6 b），其中草酸对锌的浸提能力最强，柠檬酸和富马酸次之，琥珀酸最低。除琥珀酸外，浸提液中Zn2+浓度均与其他有机酸浓度呈正相关关系，即有机酸浓度越高，可溶出Zn2+越多。与图6 a趋势相似，有机酸对土壤锌浸提的效果与其对土壤pH值的影响一致，草酸对土壤pH值的降低能力最强，其对土壤浸提态锌的溶出能力同样最强。

图6 根系分泌主要有机酸对土壤浸提液pH值、锌含量的影响

3 讨论

不同绿肥对土壤中锌的累积吸收有明显差异。不论缺锌还是施锌处理，黑麦豆（豆科）地上部锌含量与高丹草（禾本科）均呈显著差异，且黑麦豆的锌吸收累积能力较高。在Soltani等［38］的研究中也发现，豆科作物三叶草的锌吸收量显著高于非豆科作物，与本试验结果一致。不同绿肥根系分泌物在C/N、DOC、氨基酸、有机酸的分泌量之间亦有很大不同［29，39］，对土壤中锌元素的活化能力存在明显差异，故影响了植株对土壤中锌的吸收。因此，根系分泌物在绿肥吸收锌的过程中可能起着重要作用。

植物根系分泌物成分复杂，其中溶解性有机碳含量是反映植物根系通过分泌作用向根际环境中输入碳的情况［40］。相比其他两种绿肥，黑麦豆根系溶解性有机碳、总有机酸分泌量均为最高，其次为绿豆、高丹草，说明黑麦豆通过根系分泌物向根际环境中释放的有机碳较多［40］。且绿肥根系分泌4种主要有机酸量的大小为黑麦豆＞绿豆＞高丹草，豆科绿肥根系有机酸的分泌量高于禾本科高丹草。根系分泌物的组成是植物自身的生理特征，与植物的种类、遗传特性有决定性的关系。如油菜的根系分泌物主要为柠檬酸和苹果酸，而肥田萝卜的根系分泌物主要为丁二酸、酒石酸和苹果酸［41］。另一方面，植物根系分泌物的分泌量与植物生长量呈正相关关系［42］，与缺磷胁迫下的白羽扇豆排根有机酸分泌量随根的生长而增加相似［43］。本研究中随培养时间的推移，单位根系干重有机酸的分泌量呈增加趋势。

植物在环境养分胁迫时，根系分泌物的成分和数量会产生急剧的变化以适应变化的环境。与以往的研究中养分胁迫条件下作物根系分泌量呈增加的趋势结果不同［21，31，44-46］，本研究中绿肥在+Zn处理下根系有机酸分泌量高于Zn0处理。Zn0处理下，绿肥根系分泌的总有机酸含量显著降低，低锌胁迫下绿肥根系分泌的总有机酸仅为供锌水平下的60.2%～66.9%。缺锌不仅影响植株对其他元素的吸收，而且抑制根系的生长发育［47］，因此缺锌可能使绿肥根系生长受到影响，从而导致根系分泌的有机酸明显减少。Ohwaki等［48］研究发现，不同锌营养水平会改变分泌物中有机酸、糖类和氨基酸之间的相对比例。两种供锌水平相比，+Zn处理豆科绿肥黑麦豆、绿豆根系主要的4种有机酸分泌量均高于Zn0处理，而禾本科绿肥高丹草则是Zn0处理下根系有机酸分泌量高于+Zn处理，这与洪常青等［49］、张福锁［50］研究在低锌胁迫下禾本科植物根系分泌物可以活化石灰性土壤中难溶性锌的结果一致。田间试验结果表明，施锌条件下，绿肥锌含量的增幅更高，其对后茬小麦锌含量的影响也随自身吸锌能力增加而增加［20］，黑麦豆和绿豆轮作增锌效果优于高丹草［19］，这可能与黑麦豆、绿豆在锌供应充足时根系生长更为旺盛，其分泌有机酸、活化锌的能力更强有关。因此，绿肥可能通过根系释放小分子有机酸类物质，降低土壤pH值，提高可溶性有机碳含量以及土壤中植物可吸收利用的有效锌含量进而提高后茬作物锌含量。

绿肥根系草酸分泌量最高，其次为琥珀酸、柠檬酸，富马酸最低。3种绿肥草酸的分泌量均占有机酸总量的50%以上，而富马酸不超过0.5%。诸葛菜根系分泌的有机酸中草酸、苹果酸和柠檬酸为优势酸，占有机酸总量的75%以上［36］。草酸是籽粒苋根系分泌的优势酸，占有机酸分泌总量的95%以上，因而籽粒苋分泌草酸的能力强是其高效利用土壤养分的重要机理之一［51］。与袁秀梅等［52］研究结果类似，本研究发现绿肥根系分泌的4种有机酸均能显著降低土壤pH，对土壤锌均有较强的溶出能力。其中，草酸降低土壤pH及溶出锌的能力最强，具有较强的络合能力和水解能力，而柠檬酸、琥珀酸、酒石酸等多元酸的络合能力强、水解能力较弱，主要是通过络合溶解作用活化土壤中的锌和铁等营养元素［52-53］。除琥珀酸外，浸出液中Zn2+浓度与有机酸浓度呈正相关关系，曾清如等［54］研究表明，柠檬酸、草酸、酒石酸、苹果酸对土壤中微量元素活化能力较强，琥珀酸的活化能力相对较弱。随着酸浓度的增加，浸出液中铜、锌、铁、锰基本上是增加的，而琥珀酸则无明显的活化作用，其结果与本研究相一致。

4 结论

3种绿肥吸收累积锌的能力存在差异，无论是否施锌，黑麦豆吸锌量均显著高于绿豆、高丹草，并在土壤施锌时差异更大。黑麦豆根系溶解性有机碳、总有机酸分泌量均高于绿豆、高丹草。供锌提高了3种绿肥根系分泌有机酸的总量，其中黑麦豆的提升幅度相比其他较高。3种绿肥根系草酸的分泌量显著高于其他有机酸，且草酸降低土壤pH及溶出土壤锌的能力最强。黑麦豆根系溶解性有机碳及总有机酸的分泌量最高，且分泌的有机酸主要为草酸和柠檬酸，这可能是其活化土壤锌，吸收累积锌能力较高的原因。