在线二维反相液相色谱法制备芹菜中芹菜素

王天祎，侯佳佳，王超男，鲍宇晖，王建舫，李 佳，崔德凤，张永红

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

芹菜素是一种尚未开发利用完全的天然黄酮类化合物[1-2]，在水果、蔬菜中广泛存在[3]。芹菜素具有广泛的药理作用，研究表明芹菜素对多种肿瘤均具有预防、抑制生长、促进肿瘤凋亡的作用机制[4-7]；对多种原因导致的前列腺、肝脏等组织器官的病变具有防护的作用，其对中枢神经系统病变具有一定的预防作用[8-10]；芹菜素还具有抗氧化、抗菌、抗过敏、抗病毒、防护辐射损伤及预防高血压等作用[11-13]。

目前，芹菜素的制备主要是以洋苷菊为原料[14]，但此种方法制备出来的芹菜素含量很低，导致芹菜素的生产率低下，生产成本偏高，限制芹菜素的广泛应用。目前有学者从亮叶杨桐叶中提取芹菜素，在亮叶杨桐叶的水提液中加入一定量的硫酸，加热酸解，即可得到纯度为64.80%芹菜素的粗提品[7]。田东等[15]选用以含二醇基固定相的微径柱为第一维亲水保留色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC)分离柱，含C18实心微球固定相的快速柱为第二维反相液相色谱(Reversed Phase Liquid Chromatography，RPLC)分离柱，构建分离滁菊中多酚类化合物的亲水保留色谱/反相液相色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography/Reversed Phase Liquid Chromatography，HILIC/RPLC)二维系统，分离得到23个包含芹菜素的独立色谱峰。由此可见，将二维色谱分离技术应用于中药及其他植物成分的分离制备是可行的。

二维液相分离系统通常是将高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)与固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)两种装置串接在一起进行分离[16-17]，可以将一个特别复杂的成分在短时间内制备分离纯化[18]。本研究采用的二维高通量分离制备色谱系统，由主分离柱、18根捕获柱和6根二次分离柱，蠕动泵、组分分析软件、紫外检测(Ultraviolet，UV)检测器等组成。样品在每个固相捕获柱捕获到相对应的样品馏分，这些样品馏分经过洗脱后进入二维分离柱，得到纯度较高的多种馏分。二维高通量分离制备色谱系统的检测灵敏度、分离能力、保留时间和峰面积都达到较优的水平[16]；节省大量时间，拥有单次超高峰容量[19]；节约成本，它独特的功能不仅降低溶剂和阀的成本，而且还在现有的液相色谱仪上进行新的突破[20-22]。这些特性使二维液相色谱将取代许多传统的分离方法用于进行复杂样品的制备分离[23]。

因芹菜中芹菜素含量较高[24]，本研究旨在利用在线二维反相液相色谱法从芹菜中提取制备芹菜素，并采用高效液相色谱、核磁及质谱进行分析鉴定，以建立操作简单的芹菜素提取制备法。

1 材料和方法

1.1 仪器、试剂与材料

二维高通量分离制备色谱系统(Sepbox 2D-250)；高效液相色谱(Waters e2695-2998/2424)；核磁共振仪(Thermo)；液-质联用仪(LCQ Fleet)；核酸蛋白检测仪(NanoDrop2000)；电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)；高速粉碎机(鑫田企业有限公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水制备仪(上海力康发展有限公司)；真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)

乙腈、甲醇(液相级、色谱级，赛默飞世尔科技有限公司)；无水乙醇(分析纯，北京化工厂)；磷酸(MOS级，北京化学试剂公司)；重水(北京百灵威科有限公司)；C4粉(液相级，ssigma)；芹菜素标准品(液相级，sigma)。

新鲜芹菜，2017年8月购于北京市昌平区回龙观城北市场。

1.2 试验方法

1.2.1 流动相的制备 0.4%磷酸溶液：取磷酸溶液4 mL，加996 mL的超纯水，混匀备用；分别将甲醇、乙腈、0.4%磷酸溶液和超纯水过滤，超声排气备用。

1.2.2 样品的制备 将新鲜的芹菜洗净，分离根茎和叶；芹菜叶剪碎后在65 ℃鼓风干燥箱内烘干后粉碎；称取芹菜叶粉末40.0 g于500 mL锥形瓶中，加入95%乙醇400 mL，将锥形瓶放入超声机中，设定超声功率为250 W，温度为65 ℃，提取0.5 h；用孔径为0.45 μm的滤膜真空抽滤，将提取液和滤渣分离；滤渣中再次加入95%乙醇溶液280 mL，超声提取0.5 h；重复前一步骤2次；将3次提取的滤液合并，旋转蒸发浓缩至干燥，用一定体积甲醇溶出，即为芹菜粗提样品。称取该芹菜粗提样品4 g与12 g C4粉混合于旋转蒸发瓶中，加入约150 mL甲醇，超声使其溶解完全；置35 ℃，60 r/min旋转蒸发仪中旋转蒸发去甲醇，得到干燥的粉末状芹菜样品。

1.2.3 二维液相色谱的制备分离 将进样柱底端用200 mg C4填实，再取制备好的芹菜样品1 g填实，最后用C4粉将进样柱填满，连入全自动二维液相分离系统，用1.2.1的流动相洗脱。利用构建的二维液相色谱软件系统进行分析，筛选最适二维液相分离色谱条件，对芹菜样品进行分离纯化，收集各馏分备用，其中以待测样品为芹菜素样品。

1.2.4 高效液相色谱检测 取芹菜素标准品10.0 mg，加入少量甲醇溶解，用30%乙醇定容至100 mL；选用核酸蛋白检测仪(NanoDrop2000)的UV-VIS(紫外-可见光吸收光谱，Ultraviolet-visible spectroscopy)程序对芹菜素标准品进行200～800 nm全波长扫描，以30%乙醇作为基点进行调零，确定芹菜素的最适吸收波长。

称取芹菜素标准品5 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成0.5 mg/mL的芹菜素标准品溶液。分别取0.5 mg/mL的芹菜素标准品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的芹菜素标准品溶液，过滤进行高效液相色谱检测。以芹菜素标准品溶液的浓度作为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程。

将1.2.2制备各个馏分，过滤、吸取10 μL进行高效液相色谱检测，确定含有芹菜素的馏分。

1.2.5 核磁共振检测 对芹菜素标准品和芹菜素样品进行化学成分表征。将5 mg芹菜素标准品及含有芹菜素的馏分分别溶解于0.3 mL重水中，转移至核磁管中，进行核磁共振检测，利用分析软件分析，即可获得该馏分的一维1H-NMR谱以及一维13C-NMR谱，从而可以确定所得到的样品馏分是否为芹菜素。

1.2.6 质谱检测 对芹菜素标准品和芹菜素样品进行定性分析。将5 mg芹菜素标准品及芹菜素样品馏分分别溶解于0.5 mL甲醇中，过滤、检测，通过相应软件分析，获得该馏分的化学组成，与芹菜素标准品进行比对。

1.3 色谱条件

二维液相主成分分离色谱条件：流动相为甲醇、乙腈、水，梯度洗脱，条件见表1。

分析型反相色谱条件：博纳爱尔杰Venusil ASB C18色谱柱，流动相：甲醇、0.4%磷酸水溶液(甲醇和0.4%磷酸水溶液体积比为1∶1)，柱温：28 ℃，流速：0.8 mL/min，紫外检测波长：346 nm，进样量：芹菜素标准品和芹菜素样品均为10 μL。

表1 Sepbox 2D-250二维液相主成分分离色谱检测条件Tab.1 Sepbox 2D-250 Detection conditions of 2D-LC main separation chromatography

2 结 果

2.1 分离结果

芹菜样品的二维液相分离如图1所示。芹菜中活性成分组分按色谱峰触发模式，同一色谱峰收集一次。芹菜的二维液相色谱二次分离，共分15个步骤，收集84个馏分样品，将同一峰收集到的馏分样品进行合并收集，离心管做好标记。

2.2 紫外最适吸收波长的确定

芹菜素的紫外光谱中由三个主要的吸收峰组成，其中一个出现在200 nm，一个在270 nm，另一个在346 nm附近(图2)。346 nm处波长相比于其他两处吸收峰更加规则和稳定，有利于芹菜素在液相条件下的检测。选择346 nm为芹菜素的检测波长。

2.3 高效液相色谱检测

芹菜素标准曲线见图3。将所收集到的84个馏分分别进行高效液相色谱检测，图4A为芹菜素标准品色谱图。图4B为芹菜样品经二维液相色谱分离后的19号馏分高效液相色谱图。从图4中可以看出，19号馏分与芹菜素标准品的保留时间分别是19.295 min和19.646 min，且都只有一个主要的色谱峰，二者基本没有差异。表明19号馏分的主要成分为芹菜素。

图1 主成分分离色谱图Fig.1 Main separation

图2 芹菜素标准品溶液200～800 nm全波长扫描图谱Fig.2 200-800 nm UV absorption wavelength of apigenin standard

图3 芹菜素标准曲线Fig.3 Standard curve of apigenin

2.4 核磁检测结果

以质谱和核磁共振对19号馏分-芹菜素和芹菜素标准品进行分析[25]。图5A和图5B分别为芹菜素标准品和19号馏分核磁检测的C谱图和H谱图；对比芹菜素标准品和芹菜样品的检测结果图5可知，19号馏分与芹菜素标准品核磁检测图像基本一致，表明19号馏分为芹菜素。芹菜素的化学结构为C15H10O5。

2.5 质谱检测结果

图6分别是芹菜素标准品与19号馏分质谱检测的结果，对比二者的质谱图可发现19号馏分的图谱与芹菜素标准品基本相同，表明19号馏分物质结构符合芹菜素标准品的基本结构。19号馏分化学

图4 芹菜素标准品(A)和19号馏分(B)高效液相色谱图Fig.4 Chromatograms of apigenin standard and No.19 sample

图5 芹菜素标准品核磁检测13C谱图和1H谱图(A)和19号馏分核磁检测13C谱图和1H谱图(B)Fig.5 13C-NMR spectra of standard and 1H-NMR spectra of standard (A) and 3C-NMR spectra of No.19 sample and 1H-NMR spectra of No.19 sample (B)

图6 芹菜素标准品(A)和19号馏分(B)质谱检测图Fig.6 MS/MS spectrum of standard and No.19 sample

成分为芹菜素。

3 讨 论

本研究构建在线二维反相液相色谱从芹菜中分离纯化芹菜素的一套方法和流程，经过反向高效液相色谱、核磁、质谱三种方法的对比检测，结果均显示分离纯化得到的19号馏分与芹菜素标准品检测结果基本一致。表明19号馏分即为芹菜素。说明芹菜样品经过二维液相色谱分离后可以快速得到芹菜素单品，且分离到的芹菜素纯度较高达到99%，高于购买的芹菜素标准品纯度≥95%。

使用质谱和核磁共振对其鉴定，确定获得的化合物单品符合芹菜素的结构和化学组成。本研究所用方法操作简单、纯化效率高，对于复杂样品中芹菜素的制备纯化具有极大的应用价值。为芹菜素药效作用的研究提供试验基础，促使芹菜素在食品、药用领域及畜牧业上的发展。

二维液相色谱进行主成分分离色谱条件的选择，拟定采用水和乙腈作为分离芹菜素的流动相，采用紫外光检测器和蒸发光散射检测器共同检测，所得到的样品主成分分离图的分离效果并不好，且两个检测器检测效果差异并不大。将流动相换成甲醇和水后，各组分所形成的峰数量变多，但各峰之间的分离程度不够好，可见甲醇的分离效果比乙腈好。采用甲醇、乙腈、水三个流动相，且检测条件如表1时，得到的样品主成分分离图效果最好，各峰之间的分离程度足够，故采用表1分离条件为芹菜素二维液相主成分分离色谱条件。

利用该方法分离芹菜样品，共分15个步骤，收集84个馏分样品。初步鉴定1个有效成分即芹菜素，而其他83个馏分有待进一步研究。为后续鉴定奠定基础。总体而言，该方法操作简便、分离效果好，为中药等复杂体系的分离分析提供一种很好的方法。