丹参提取液对感染大肠杆菌小鼠细胞因子含量的影响及安全性评价

侯佳佳，王天祎，申维维，胡 迪，张永红，崔德凤

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室/动物类国家级实验教学示范中心，北京 102206)

随着饲料工业的发展，抗生素和化学药物对畜牧业的危害越来越受到人们的重视[1-3]，20世纪末，在畜牧业养殖过程中，为了防治畜禽的各类疾病，滥用抗生素类药物尤其是饲用抗生素，引起大范围畜禽细菌耐药性的产生以及体内的药物残留问题[4]，面对细菌抗药性问题日益严重的现状，抗生素替代品日益受到关注。研究发现，中草药在替代抗生素预防、治疗某些疾病过程中，凸显重要作用。中草药免疫调节剂在动物机体内有不同程度调节免疫功能的作用，进而起到预防、治疗疾病的作用。开发安全性高的中药饲料添加剂替代原有的抗生素及化学药物将是未来发展之必然趋势。

丹参在中国作为传统药材使用已经有几千年的历史，丹参(Salviamiltiorrhizabunge)又名赤参、紫丹参、红根等，始载于《神农本草经》[5]，并被奉为上品，作为经典活血化瘀中药，于2009年被选入《国家基本药物目录》。其为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)，以干燥根及根茎入药。其性微寒，味苦，归心、肝二经。功能有活血祛瘀、凉血、清心安神等。丹参含有脂溶性和水溶性有效成分。脂溶性的包括丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮等，有杀菌、消炎等药理作用；水溶性的包括丹参素、丹酚酸等，具有抗凝血和抗血栓形成以及细胞保护等作用[6]。近年来丹参提取液的药理作用研究不断深入，临床上常用于血瘀、疮痈、心神烦躁等症状的治疗，而对于机体免疫活性的调节及抗感染机制的研究报道罕见，本文以此为切入点，对丹参提取液进行深入研究与探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中药丹参片购自北京同仁堂回龙观药店；28日龄雄性昆明小鼠，购自北京兴隆实验动物养殖场；无水乙醇、氯化钠购自泰科兰博北京生物技术有限公司；供试菌株EscherichiacoliO101，北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室保藏；小鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫分析试剂盒、小鼠免疫球蛋白A(IgA)酶联免疫分析试剂盒、小鼠免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫分析试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒购自北京华佰泰生物科技有限公司。营养肉汤、麦康凯培养基购自北京爱普锐晟科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 药品制备 药材使用水煎法制备。将丹参烘干后称取100 g，加10倍体积的超纯水室温浸泡30 min，大火煮沸后转慢火煎熬30 min，滤出药液。丹参药渣加入8倍体积蒸馏水，煮沸后文火煎熬20 min，滤出药液，合并2次药液，用旋转蒸发仪浓缩至100 mL。

1.2.2 药液浓度选择 参考丹参人体推荐用量的10倍、5倍、1倍，设丹参提取液的浓度为0.0195、0.0390、0.0780 g/mL。

1.2.3 动物试验及分组处理 适应性饲养结束后，将小鼠随机分为5组，每组22只小鼠，分别为对照组、大肠杆菌模型组、试验组。试验组分为低浓度试验组、中浓度试验组、高浓度试验组，分别使用0.0195、0.0390、0.0780 g/mL丹参提取液进行灌胃处理，每日定时定量1次，连续28 d。小鼠体重以20 g计，按390 mg/kg量进行灌胃，即每次每只试验鼠灌胃0.2 mL。对照组灌胃给予0.2 mL的生理盐水，操作同试验组。

1.2.4 体重的测定 适应性饲养结束第1天记录小鼠重量。且在分组给药试验过程中分别于7、14、21、28 d称量并记录体重。

1.2.5 大肠杆菌菌悬液制备 将保存的E.coliO101摇管复苏，盲传3代，于麦康凯培养基中纯化培养，选取生长状态良好的独个菌落接种于肉汤培养基中37 ℃、220 r/min摇床中震荡培养18 h，保存于4 ℃冰箱备用。

1.2.6 大肠杆菌LD50测定 经大肠杆菌攻毒试验计算得出这株E.coliO101的半数致死量。在3组小鼠连续灌胃丹参提取液28 d后，将新鲜培养所得的E.coliO101按半数致死量对灌胃丹参提取液的试验组和大肠杆菌模型组腹腔注射0.2 mL/只，而对照组腹腔注射0.2 mL/只的无菌生理盐水，观察24 h。

1.2.7 攻毒后血清采集 于腹腔注射E.coliO10124 h后，每组试验鼠选取3只摘眼球取血，采血量约为0.8～1.0 mL。全血按组别装入干净EP管中室温静置30 min，在高速冷冻离心机3 000 r/min离心15 min，将得到的血清-80 ℃保存备用。

1.2.8 ELISA检测 小鼠血清IL-6、TNF-α及IgG、IgA采用双抗体夹心法测定，严格按照免疫试剂盒检测说明书进行。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算出标准曲线的直线回归方程式，计算出样品浓度。

1.3 数据处理与分析

测得数据均用SPSS软件进行统计处理，结果用均值±标准差(Mean±SD)表示，用单因素方差分析差异显著性。无标注表示差异不显著(P>0.05)，标注*表示差异显著(P<0.05)，标注**表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 丹参提取液对小鼠体重的影响

连续给药7 d时，试验组与对照组小鼠平均体重无显著差异(P>0.05)；在14、21、28 d时，中浓度试验组和高浓度试验组小鼠平均体重均显著高于对照组(P<0.05)，且在28 d时，低浓度试验组小鼠平均体重显著高于对照组，试验组之间无显著差异(图1)。

从小鼠平均体重来看，中浓度试验组、高浓度试验组对小鼠增重有明显促进作用，低浓度试验组随着给药时间的延续，增重逐渐明显。由此可见，长期(>7 d)灌服不同浓度的丹参提取液对机体表现为不同程度促进生长的作用。

2.2 丹参提取液对小鼠血清生化指标的影响

在血清蛋白含量方面，试验组与对照组差异显著(P<0.05)，且以中浓度试验药物效果最好，极显著促进小鼠血清蛋白的分泌；试验组血清葡萄糖含量显著高于对照组，分析可能是丹参提取液中的丹参多糖含量高，提高小鼠的血糖水平；在肝功能指标方面，试验组与对照组相比，谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALKP)在血清中浓度无显著差异，丹参提取液对小鼠的肝脏无损害作用，具有安全性，可用于治疗与饲喂。在肾功能指标方面，低浓度试验组、中浓度试验组小鼠血清肌酐含量均在正常值范围内，而高浓度试验组高于对照组范围的4倍，分析可能高浓度试验组的丹参提取液对小鼠的肾功能有轻微不良作用，原因和机制还有待进一步研究(表1)。

注：与对照组相比，标注 * P<0.05；标注 ** P<0.01。Note: Compared with the control group, the mark *P<0.05; mark ** P<0.01.图1 不同浓度丹参提取液对小鼠平均体重的影响Fig.1 Curve of effect of different doses of S. miltiorrhiza extract on body weight of mice

表1 小鼠血清生化指标Tab.1 Mouse serum biochemical indicators

注：与对照组相比，标注 *P<0.05；标注 **P<0.01。

Note: Compared with the control group, the mark *P<0.05; mark **P<0.01.

2.3 E. coli O101攻毒试验

小鼠腹腔注射大肠杆菌约5 h后，均发生小鼠大肠杆菌发病症状：精神不振、软便、食欲减退等。死亡小鼠发生在12～24 h内，不同浓度E.coliO101菌悬液致小鼠的死亡情况见表2。通过SPSS软件，得出E.coliO101对小鼠的半数致死量为2.75×108CFU/mL。

对每组试验鼠腹腔注射浓度为2.75×108CFU/mL的E.coliO101菌液0.2 mL/只，同时对照组腹

腔注射0.2 mL/只的无菌生理盐水做对照，24 h后观察试验鼠的精神状况、排便情况及致死率。大肠杆菌模型组小鼠的粪便的细菌培养呈阳性，表明本次试验中对小鼠接种大肠杆菌造模成功。大肠杆菌模型组在攻毒5 h后出现症状，多半小鼠表现为精神沉郁，眼睑出现红肿，眼鼻分泌物增多，活动量减少，无食欲，被毛倒立，软便。在24 h内，致死率为60%，毒性强。

在攻毒前给予丹参提取液预防干预的试验组小鼠的致死率显著低于大肠杆菌模型组(P<0.01)，且试验组小鼠的精神状况有所改善，腹泻症状不明显，产生抗病性的小鼠恢复期比大肠杆菌模型组稍早。在试验组之间两两相互比较可以看出，三种丹参提取液的浓度之间无显著差异，以中浓度试验组的丹参提取液致死率最低，药效最佳(表3)。

表2 小鼠人工感染大肠杆菌LD50测定Tab.2 mouse LD50 assay of E. coli infected

表3 丹参提取液对小鼠E. coli攻毒的影响Tab.3 Effect of different doses of S. miltiorrhiza extract on lethality in mice

注：与对照组相比，标注 *P<0.05。

Note: Compared with the control group, the mark *P<0.05.

2.4 丹参提取液对攻毒后小鼠血清IgG的影响

大肠杆菌模型组小鼠血清IgG与对照组相比，极显著降低(P<0.01)，见图2。在使用丹参提取液干预28 d后，高浓度试验组的小鼠血清Ig G浓度极显著高于对照组(P<0.01)，而低浓度试验组、中浓度试验组与对照组比较，无显著差异(P>0.05)。试验组小鼠血清IgG浓度均显著高于大肠杆菌模型组(P<0.05)，且高浓度试验组与大肠杆菌模型组差异极显著(P<0.01)。

当大肠杆菌侵入小鼠机体后，可使其血清中IgG水平明显降低，引起小鼠的免疫机能下降。而使用28 d预防用丹参提取液后，可提高攻毒后小鼠血清IgG的浓度水平，且随着药物浓度的升高，对小鼠的免疫调节作用越好，高浓度的丹参提取液对小鼠的免疫调节效果较好。

2.5 丹参提取液对攻毒后小鼠血清IgA的影响

血清IgA的测定结果显示，对照组浓度略低于大肠杆菌模型组与高浓度试验组(P>0.05)，见图3。试验组之间小鼠血清IgA的浓度均无显著差异，即还不能认为丹参提取液对大肠杆菌攻毒后小鼠血清中IgA具有调节作用。

注：与对照组相比，标注 * P<0.05，** P<0.01；与大肠杆菌模型组相比，标注 # P<0.05， ## P<0.01。Note: Compared with the control group, the mark **P<0.01; compared with the model group, the mark # P <0.05, the mark ## P<0.01.图2 攻毒后小鼠血清IgG的变化Fig.2 Concentration of serum IgG in mice after challenge

注：与大肠杆菌模型组相比，标注 # P<0.05；标注 ## P<0.01。Note: Compared with the model group, the mark # P<0.05, the mark ##P<0.01.图3 攻毒后小鼠血清IgA的变化Fig.3 Concentration of serum IgA in mice after challenge

2.6 丹参提取液对攻毒后小鼠血清IL-6的影响

由图4可知，与对照组相比，大肠杆菌模型组小鼠的血清IL-6的水平显著升高(P<0.05)，存在统计学意义，而试验组的血清IL-6水平与对照组比较，均无显著差异，高浓度试验组IL-6浓度略高于对照组，但无统计学意义(P>0.05)。与大肠杆菌模型组相比较，可以看出试验组IL-6浓度均显著降低，且差异显著(P<0.05)。试验组两两相互比较可见，三个组之间IL-6浓度水平相当，均无显著差异(P>0.05)。

注：与对照组相比，标注 * P<0.05；与大肠杆菌模型组相比，标注 # P<0.05。Note: Compared with the control group, the mark *P<0.05; compared with the model group, the mark # P<0.05.图4 攻毒后小鼠血清IL-6的变化Fig.4 Concentration of serum IL-6 in mice after challenge

大肠杆菌毒素可以引起小鼠血清IL-6水平的升高，而使用丹参提取液预防干预的小鼠血清IL-6浓度被轻微抑制，丹参提取液能够降低小鼠血清中致炎性细胞因子IL-6的含量。

2.7 丹参提取液对攻毒后小鼠血清TNF-α的影响

由图5所示，与对照组相比，大肠杆菌模型组的小鼠血清TNF-α浓度显著升高(P<0.01)，预示机体产生炎症反应，E.coli造模成功。与大肠杆菌模型组相比，试验组小鼠血清TNF-α浓度显著降低(P<0.05)，低浓度试验组、高浓度试验组差异极显著(P<0.01)，以低浓度试验组对小鼠血清TNF-α浓度的降低作用最显著。

大肠杆菌毒素会引起小鼠血清TNF-α水平的升高，而使用丹参提取液预防干预的小鼠血清TNF-α被抑制，表明丹参提取液能够降低小鼠血清中致炎性细胞因子TNF-α的含量，且以低浓度效果最好。

注：与对照组相比，标注 ** P<0.01；与大肠杆菌模型组相比，标注 # P<0.05，标注 ## P<0.01。Note: Compared with the control group, the mark **P<0.01; compared with the model group, the mark # P<0.05, the mark ## P<0.01.图5 攻毒后小鼠血清TNF-α的变化Fig.5 Concentration of serum TNF-α in mice after challenge

2.8 丹参提取液对E. coli O101模型小鼠血清生化指标的影响

由图6可以看出，E.coliO101腹腔注射进入小鼠体内作用5 h后，血清中ALT、AST活性较未注射E.coliO101小鼠血清中ALT、AST活性显著升高。说明E.coliO101产生的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)对小鼠的肝功能造成一定的损伤；而用不同浓度的丹参提取液提前保护后，腹腔注射E.coliO101的小鼠血清中ALT、AST浓度均较大肠杆菌模型组显著降低，试验组的ALT活性与对照组无显著差异，达正常水平。

注：与对照组相比，标注 ** P<0.01；与大肠杆菌模型组相比，标注 ## P<0.01。Note: Compared with the control group, the mark **P<0.01; compared with the model group, the mark ## P<0.01.图6 丹参提取液对攻毒后小鼠血清AST和ALT指标的影响Fig.6 Effect of S. miltiorrhiza extract on serum AST and ALT index in mice after challenge

3 讨 论

丹参的主要活性成分可经水煎法、回旋蒸发法以及水提醇沉等方法获取出来[7]，易于提纯，且含量较高，具有预防、治疗多种疾病的作用。丹参的有些成分已用于临床治疗，但尚有许多药理作用仍未被利用，因此充分挖掘丹参有效成分对预防、治疗疾病，推动中兽药现代化的发展具有重要意义。有研究表明，丹参多糖可提高机体血清中TNF、IL-1、IL-2、IL-6的含量[8]。多糖是天然具有活性的产物，不仅可以提高机体免疫力，对疾病有一定程度的预防，并且没有耐药性、毒副作用较小，因此是良好的免疫调节剂，在免疫方面拥有远大的前途[9]。从丹参根中提取到多糖，通过灌胃方式治疗肾损伤和肝损伤模型小鼠，其能减少模型组的蛋白尿症状，抑制血清总胆固醇(cholestenone，CHOL)和脂质过氧化物浓度的提高，改善血清中蛋白的比例，并能降低由肝损造成的ALT升高[10]。

在医学上检测血清中ALT、AST是体现肝功能的关键指标。ALT主要在肝细胞的胞浆内，AST主要在肝细胞微粒体中。AST与ALT都为胞内膜，健康状态下无法穿过肝细胞膜，胞内酶的含量远远高于胞外[11]。当肝细胞遭受损伤，膜的结构和功能受到破坏时，胞内酶进入血液，导致血清中酶活力明显增加，其升高程度与肝细胞的受损程度呈正相关[12]。本试验经测定小鼠血清中ALT、AST水平，分析丹参提取液对小鼠肝脏的保护作用[13]。根据数据分析，试验组小鼠血清AST、ALT等肝功指标与对照组无显著差异(P>0.05)，可初步判断各浓度丹参提取液对小鼠的肝脏无损害作用，具有安全性，可用于治疗与饲喂。

本研究采用大肠杆菌给动物腹腔注射以引起机体的炎症反应，建立小鼠炎症模型，并从小鼠的LD50、免疫细胞因子水平及血清生理生化指标探讨对小鼠免疫功能的影响，从而揭示其可能的免疫调节机制，为丹参提取液的进一步开发及临床应用提供依据。

大肠杆菌是一种常见的G-，当其侵入机体后会释放出LPS，诱导机体的炎症反应。小鼠腹腔注射大肠杆菌会导致急性腹膜炎，会使小鼠出现休克症状，最终走向死亡[14]。而炎症就会引发机体各类免疫细胞产生多种炎性介质和细胞因子，如TNF-α、IL-6等。TNF-α及IL-6都属于炎症前因子。炎症前因子的主要作用是在局部利用刺激免疫细胞攻击的方式发挥其作用。

TNF-α作为炎症前因子可以诱导出机体的免疫反应，是炎症损伤的重要因素之一，具有细胞毒作用，能激活T、B淋巴细胞，增加自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的能力，还可以诱导TNF-α本身和IL-6等细胞因子的大量分泌，增加炎症应答过程中对机体的损害。

IL-6是一种炎症促进因子，其浓度的升高可增加炎症反应的程度[15]。在炎症应答过程中有举足轻重的作用。另外，它还能促进B细胞的增殖与分化，促进造血干细胞的再生与血小板产生。

本研究中，用ELISA方法检测感染大肠杆菌后小鼠血清中TNF-α、IL-6、IgG及IgA的水平，用不同浓度的丹参提取液提前灌服均能有效抑制小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌，对抑制IL-6过多释放的作用效果最为明显。说明丹参提取液可以通过下调TNF-α、IL-6的水平缓解炎症损伤。同时丹参提取液有效提高了小鼠血清中IgG的水平，提高了机体对病原微生物侵入机体的抵抗能力。当致病性大肠杆菌入侵时，通过促进机体分泌免疫球蛋白，中和病原微生物，从而提高机体的免疫能力。

丹参提取液能调节大肠杆菌诱导的小鼠肠道炎症的免疫调节作用，通过抑制小鼠血清中IL-6与TNF-α的水平，减少炎症对机体的损害作用，发挥抗炎作用。