地鳖肽对C2C12细胞氧化损伤的保护作用

徐小艾，陈靖阳，黄 山，孙英健，沈 红

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

骨骼肌主要由成肌细胞发育而来，约占动物体重的40%～60%，骨骼肌的生长发育对于畜禽的产肉性能具有非常重要的影响[1]。随着畜禽集约化养殖程度不断提高，氧化应激发生愈发普遍，氧化应激造成过量自由基的产生会影响畜禽的肉品质。正常生理状态下骨骼肌的生长发育十分稳定，当骨骼肌处于氧化应激状态时，原处于静息状态的骨骼肌卫星细胞会被激活，进而增殖、分化、融合形成多核肌管，迁移至骨骼肌受损部位修复骨骼肌[2]。近年来，Nrf2-ARE作为公认的经典抗氧化通路，可调控多种抗氧化酶蛋白的转录和表达[3]，通路由Nrf2、Keap1、ARE三个核心分子构成，其中Nrf2是关键分子[4]。在正常生理状态下，Keap1的富含双甘氨酸的结构域和Nrf2的Neh2结构域中的亲水区结合，Keap1作为细胞质阻遏物在细胞质中隔离Nrf2，从而阻断Nrf2的核易位和随后ARE的反式激活[5]。在氧化应激刺激下，细胞处于氧化应激状态，使胞内Keap1构象发生改变，进而对Nrf2的泛素化作用减弱或消除，Nrf2与Keap1解离激活转移入核，核内Nrf2与抗氧化反应元件ARE结合，启动Nrf2-ARE信号通路，下游超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血红素加氧酶1(HO-1)等在内的抗氧化应激蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化应激的能力[6]。

地鳖虫早有记载，其拥有活血解凝、消肿止痛、接骨续筋等功效[7]。现代医学研究证明，地鳖虫具有溶解血栓、调节血脂、抗癌等功效[8-10]。蛋白酶解地鳖获得短肽具有较强的抗氧化作用[11]。本试验拟以地鳖肽处理过氧化氢刺激的C2C12细胞，免疫荧光、Western Blot、RT-PCR法等方法检测Nrf2核转位及Nrf2-ARE信号通路下游相关基因表达，目的探索地鳖肽对H2O2诱导的C2C12细胞氧化损伤的保护作用，以期为未来开发地鳖肽用于畜禽养殖过程中预防氧化应激提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

C2C12细胞株由北京农学院动物育种及辅助生殖实验室惠赠。

噻唑蓝(MTT)购于BIO-NEW公司(C-0068)，Nrf2、HO-1抗体均购自Abcam公司(ab62352)、(ab52947)，所用引物由生工生物工程股份有限公司合成，地鳖肽提取物由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室制备，叔丁基对苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)购自上海麦克林生化科技有限公司。全自动酶联免疫检测仪购自上海美普达有限公司，核酸蛋白测定仪购自美林恒通仪器有限公司，荧光PCR仪购自Applied Biosystems公司，C-dight化学成像发光仪购自LI-COR公司。

1.2 方 法

1.2.1 试验分组与处理 C2C12细胞复苏后，待细胞贴壁密度达80%～90%时进行传代分组培养，试验分为对照组、H2O2组、H2O2+地鳖肽组、H2O2+TBHQ组，每组设3个重复。地鳖肽处理细胞24 h后，除对照组外，其余各组加入400 μmol/L H2O2刺激细胞8 h。

1.2.2 C2C12细胞活力检测与细胞形态观察 C2C12细胞接种于6孔板，经分组处理后，MTT法检测细胞活力。C2C12细胞接种于6孔板，经分组处理后，PBS洗3次，倒置显微镜拍照观察细胞形态。

1.2.3 分光光度计检测抗氧化酶及脂质过氧化产物 C2C12细胞接种于6孔板，经分组处理后，PBS悬浮细胞，反复冻融破碎细胞，取细胞悬液检测蛋白浓度。根据SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒检测说明操作。

1.2.4 免疫荧光法检测Nrf2核移位情况 C2C12细胞接种于玻片，经分组处理后，多聚甲醛固定，破膜，山羊血清封闭，4 ℃孵育一抗过夜，37 ℃孵育二抗1 h，DAPI对细胞核进行染色 15 min，激光共聚焦显微镜拍照。

1.2.5 Western Blot法检测Nrf2和HO-1蛋白表达 分组处理细胞，弃去培养基，预冷PBS洗，吸弃上清，每1 mL RIPA裂解液中加入10 μL PMSF，每孔150 μL，使其充分与细胞接触，置于冰上5 min，细胞刮刀刮取细胞，置于1.5 mL EP管中，冰中孵育10 min，4 ℃ 12 000 g离心5 min，收集上清并用BCA法测定蛋白含量。取等量蛋白进行Western Blot试验检测。

1.2.6 RT-PCR法检测Nrf2和抗氧化酶基因mRNA表达 分组处理细胞，提取细胞RNA，核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和OD260/280值，当OD260/280值在1.9～2.1之间时符合检测要求。按照HiFi-MMLV cDNA Kit说明，反转录RNA，获得cDNA。

引物根据GenBank中的序列用Primer5.0软件设计而成，由生工生物工程股份有限公司制作合成(表1)，荧光定量PCR检测分析基因相对表达量。

1.2.7 统计分析 试验数据使用平均值±标准差表示，用Microsoft Excel对试验结果进行整理并在试验组间进行方差分析，当P≤0.05为差异显著，用*和+表示，当P≤0.01为差异极显著，用**和++表示。

表1 SYBR real-time PCR 反应引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR

2 结 果

2.1 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞活力及形态的影响

MTT检测细胞活力，结果H2O2组与对照组比较，细胞活力极显著降低，H2O2+TBHQ组与H2O2+地鳖肽组比H2O2组均极显著升高，随着地鳖肽浓度增加细胞活力提高超过80%(图1)。采用倒置显微镜观察细胞形态，对照组C2C12细胞呈梭形或纺锤形，细胞明亮，分布均匀，相互接触并联结成网(图2A)；H2O2组细胞有明显肿胀，排列稀疏杂乱，彼此连接减少，有部分细胞脱落贴壁不实(图2B)；与H2O2组比较，H2O2+地鳖肽组大部分细胞形态恢复至梭形，细胞密度升高，大致趋于正常形态(图2C)。

注：与对照组相比，**P≤0.01；与H2O2组相比，+P≤0.05，++P≤0.01。Note：Compared with control group, **P≤0.01; compared with H2O2 group, +P≤0.05, ++P≤0.01. 图1 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞活力的影响Fig.1 Effects of ESP on H2O2-stimulated C2C12 cells viability

注：A是对照组，箭头标记处为细胞正常形态；B是H2O2组，箭头标记处为氧化损伤细胞形态；C是H2O2+地鳖肽组，箭头标记处为药物保护作用下细胞形态。Note:A is control group, the arrow mark is the normal form of cells; B is H2O2 group, the arrow mark is the shape of oxidative damage cells; C is H2O2+ESP group, the arrow mark is the cell morphology under drug protection.图2 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞形态的影响(400×) Fig.2 Effects of ESP on the morphology of H2O2-stimulated C2C12 cells (400×)

2.2 地鳖肽对抗氧化酶和过氧化物(MDA)生成的影响

抗氧化酶的活性反映机体的抗氧化能力，MDA是脂质过氧化的产物，其含量反映机体组织细胞过氧化程度。本研究采用分光光度计法检测细胞内抗氧化酶活力、过氧化物(MDA)含量，结果与对照组相比，H2O2组抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力均极显著降低，MDA含量显著升高；与H2O2组相比，H2O2+TBHQ组或H2O2+地鳖肽组细胞内抗氧化酶的活力均极显著提高，其中SOD活性提高最大，MDA含量降低(图3)，地鳖肽提高细胞抗氧化能力，降低细胞过氧化反应。

注：与对照组相比，* P≤0.05，**P≤0.01；与H2O2组相比，+ P≤0.05， ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, **P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.图3 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞抗氧化酶及MDA蛋白表达量的影响Fig.3 Effect of ESP on antioxidant enzymes and MDA content in H2O2-stimulated C2C12 cells

2.3 地鳖肽对细胞内Nrf2核移位的影响

通过免疫荧光法确定细胞Nrf2核移位情况，对照组Nrf2主要分布在细胞质中，细胞核内有极少量的荧光标记Nrf2的表达；H2O2+TBHQ组细胞作为Nrf2激活的阳性对照，其细胞核内的Nrf2蛋白绿色荧光表达明显增多；H2O2组细胞质与细胞核Nrf2蛋白均稍有增多；H2O2+地鳖肽组细胞核内Nrf2绿色荧光比H2O2组明显增加，与H2O2+TBHQ组接近，H2O2+地鳖肽组促进Nrf2核移位(图4)。

注：箭头标记处为细胞核内Nrf2蛋白表达增加。Note: The arrow mark indicates an increase in Nrf2 protein expression in the nucleus.图4 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞Nrf2核移位的影响(800×)Fig.4 Effects of ESW polypeptide on the shift of Nrf2 in C2C12 cells stimulated by H2O2(800×)

2.4 地鳖肽对细胞内Nrf2和HO-1蛋白表达水平的影响

采用Western Blot检测Nrf2和HO-1蛋白表达，细胞受到H2O2刺激，Nrf2和HO-1的蛋白表达量稍有升高，但差异不显著；H2O2+TBHQ组与H2O2+地鳖肽组Nrf2和HO-1表达均显著高于对照组与H2O2组，差异显著，而且H2O2+地鳖肽组Nrf2蛋白表达高于H2O2+TBHQ组(图5)。

注：与H2O2组相比，+P≤0.05。 Note:Compared with H2O2 group, +P≤0.05.图5 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞Nrf2和HO-1蛋白表达的影响Fig.5 Effect of ESP on the expression of Nrf2 and HO-1 in C2C12 cells stimulated by H2O2

2.5 地鳖肽对细胞内Nrf2及抗氧化酶基因mRNA表达的影响

采用RT-PCR法检测细胞内抗氧化通路因子Nrf2及抗氧化酶mRNA表达。H2O2组比对照组细胞显著下调Nrf2的表达，叔丁基对苯二酚(TBHQ)及不同浓度地鳖肽处理细胞后，细胞内Nrf2表达量均有所提高，其中药物在400 μg/mL时具有显著差异(图6)。

与对照组相比，H2O2下调抗氧化酶SOD2、CAT、GSH-Px、HO-1的表达量，且差异显著；与H2O2组相比，叔丁基对苯二酚及不同浓度地鳖肽处理的细胞其抗氧化酶表达量均升高，地鳖肽为100 μg/mL时SOD2和GSH-Px表达极显著上调，SOD1、CAT、HO-1相对表达量虽高于H2O2组，但无显著差异，地鳖肽在200 μg/mL时，抗氧化酶表达量均显著或极显著上调，地鳖肽药物升至400 μg/mL后，显著或极显著上调SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px表达量，HO-1相对表达量虽高于H2O2组，但无显著差异(图6)。

3 讨 论

Nrf2-ARE信号通路抗氧化途径已受到广泛的研究，当机体发生氧化应激时，过量产生的活性氧，可以激活该通路，Keap1释放Nrf2，进而转移入核，与细胞核内抗氧化原件ARE结合，启动下游抗氧化基因的转录与表达用以抵抗氧化应激的过度发生[12]。SOD、CAT和GSH-Px等是最主要的抗氧化酶，在氧化应激过程中，能够清除多余的自由基，MDA是脂质过氧化的产物，其含量反映过氧化程度。赵磊等研究发现，茶多酚通过提高细胞内SOD、CAT、GSH-Px的活性中和产生过多的ROS，缓解氧化应激对细胞的损伤作用[13]。齐晓龙等发现CLA可显著提高蛋鸡血清和肝脏中SOD、CAT、GSH-Px活力并显著降低MDA含量[14]。本研究显示，地鳖肽显著缓解H2O2对C2C12细胞活力的抑制作用，在细胞形态的恢复上具有同样的体现。进一步检测细胞内SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性及脂质过氧化产物MDA的含量，地鳖肽对细胞内抗氧化酶活性呈促进作用，MDA含量降低。

HO-1是Nrf2-ARE信号通路下游表达的重要抗氧化蛋白之一，能够催化血红素降解产生等摩尔量的胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁，血红素是一种强效的氧化剂，而胆绿素和CO转化胆红素具有抗氧化活性，因此，HO-1对机体氧化应激过程提供保护作用[15]。梁嫣然等研究发现，利福平能够诱导Nrf2的核转位及上调HO-1蛋白的表达；在使用基因沉默法抑制HO-1基因表达后，可逆转利福平

注：与对照组相比，*P≤0.05，** P≤0.01；与H2O2组相比，+ P≤0.05， ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, ** P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.图6 地鳖肽对H2O2刺激C2C12细胞Nrf2及其下游抗氧化酶基因mRNA表达量的影响Fig.6 Effects of ESP on the expression of Nrf2 and antioxidant enzyme mRNA in C2C12 cells stimulated by H2O2

预处理对鱼藤酮诱导的氧化损伤的抑制作用[16]。姜璐等研究表明，银杏内酯A通过上调Nrf2、HO-1、GSH的表达进而对四氯化碳诱发的HepG2细胞损伤起到保护作用，同时抑制氧化应激反应[17]。

地鳖肽显著缓解H2O2对C2C12细胞活力的抑制作用，在细胞形态的恢复上具有同样的体现。进一步检测细胞内SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶及脂质过氧化产物MDA的表达量，地鳖肽对细胞内抗氧化酶的表达呈促进作用，MDA表达量降低。地鳖肽能够促进Nrf2的表达及其核移位，进而激活Nrf2-ARE信号通路，增强细胞抗氧化能力。运用Western Blot技术检测细胞内Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的蛋白表达量，与免疫荧光结果相一致，地鳖肽显著促进细胞内Nrf2和HO-1的蛋白表达。地鳖肽可能通过启动细胞Nrf2-ARE信号通路关键分子，促进抗氧化蛋白表达，呈现抗氧化作用。

地鳖肽可能通过增加细胞内Nrf2-ARE信号通路中重要分子的表达，启动Nrf2-ARE信号通路实现抗氧化的作用。本研究结果为开发地鳖肽作为一种天然抗氧化剂提供依据，同时为地鳖深加工及高值化利用提供新的思路。