一个大豆矮秆性状基因的分子标记定位

袁 鹰，王 程，韩 俊，张 鑫，仝 潇，冯凡育，谢 皓

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

株高对作物生长的群体结构和产量来说是很重要的农艺性状[1]。近年来，随着分子生物学和基因组学的飞速发展，对作物高产性状、高产机理及其相关基因的研究愈加深入，培育理想株型已成为作物育种的重要目标[2]。合理株型是高产品种的生育基础和形态特征，其中矮秆是理想株型的一个重要性状[3]，矮秆基因的利用对于20世纪“绿色革命”起到决定性作用[4]。例如，将大豆中抗倒伏的有限结荚习性基因dt1转育到无限结荚习性的北方高产品种中，育成Elf、Sprite、Hobbit、Gnome等半矮秆品种，在高产环境下采取高密度种植实现超高产，并得到大面积推广应用[5]。

前人曾用传统的统计分析方法研究大豆株高的遗传规律，认为株高是多基因控制的数量性状，遗传力较高，受1～2对主效基因和微效多基因控制[6-7]，陈恒鹤等[8]研究指出“矮源矬”的株高性状受1对隐性主效基因和多个修饰基因共同控制，而Kilen等研究表明大豆品种PI227224的矮秆性状是由单个隐性基因控制[9-10]。Hwang等[11]在辐照大豆种子的快速鉴定中得到1个矮秆突变体，通过全基因组关联分析表明，存在1个803 bp的缺失区域可能与矮秆表现型相关。Cheng等[12]用γ射线诱变M2群体大豆得到2个都是隐性遗传方式的突变体Gmdwf1和Gmdwf2。Li等[13]用EMS诱变大豆栽培品种中品661，得到1对隐性核基因控制能明显降低株高和缩短茎节尖的DW突变体。

本课题组在育种工作中，利用海系13为母本与父本北农103杂交，在(海系13×北农103)F4部分剩余杂合体分离群体(RHL)中发现高秆/矮秆性状分离明显。北农103为北京市审定的夏播品种，从中黄18种子60Co-γ辐照的衍生后代选育而成，而中黄18的杂交组合为中品661×Century-2。Century-2是优良品种Century(不含脂肪氧化酶-Lox)的近等基因系，推测分离后代中的矮源可能来自Century-2，而对Century-2和Century株高方面的研究尚无报道。

本研究拟通过对(海系13×北农103)F4RHL的F2高秆/矮秆分离群体的遗传分析，解析高秆/矮秆性状的遗传规律，并利用F2∶3分离群体对其中北农103中控制矮秆RHL性状的基因进行分子标记与定位，为该基因精细定位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1套(海系13×北农103)F4RHL的F2分离群体，由北京农学院大豆课题组选育。其中，海系13为南京菜用春大豆品种，株高90 cm；北农103为北京市审定的夏播品种，株高55 cm；F2分离群体中高株平均90 cm，矮株平均35 cm。SSR引物，由北京鼎国昌盛有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 高秆/矮秆分离群体鉴定与遗传分析 在大豆鼓粒期对(海系13×北农103)F4RHL的F1和F2代高秆/矮秆田间鉴定，并对F2中表现高秆/矮秆分离株系的鉴定结果进行卡方检验。

1.2.2 大豆基因组DNA提取及分子标记 采用CTAB法对(海系13×北农103)F4RHL中F2∶3群体的单株叶片进行基因组DNA的提取。采用BSA法，根据田间调查结果，分别用F2∶3群体中6个高秆和6个矮秆单株构建DNA高秆池和矮秆池，初步筛选控制矮秆基因的分子标记；利用(海系13×北农103)F4RHL中F2∶3群体对初选标记进行验证。

1.2.3 PCR扩增与电泳 用Bio-Rad PCR仪进行扩增。PCR反应体系为10 μL，包括正向引物0.5 μL(0.2 μm/L)，反向引物0.5 μL(0.2 μm/L)，PCR Mix 5 μL，DNA模板2 μL(15～25 ng/μL)，ddH2O 2 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=39∶1)电泳的方法进行检测。点样量为1.8 μL，150 V电泳1.5～2 h。采用快速银染法染色显带，照相后统计带型。

1.2.4 数据分析和遗传作图 将统计的带型用Mapmaker3.0软件(LOD值取3.0)计算筛选出的分子标记与矮秆基因间遗传距离；采用MapDrawV2.1软件构建遗传连锁图谱；参照大豆遗传连锁图谱(www.soybase.org)进行基因定位。

2 结果与分析

2.1 高秆/矮秆大豆表型性状的遗传分析

注：左为高秆植株，右为矮秆植株。Note:Left is tall plant, Right is dwarf plant.图1 (海系13×北农103)F4RHL的F2株高分离表现Fig.1 (HaiXi 13×BeiNong 103) F2 of F4RHL plant height separation performance

2.2 GmD1基因SSR标记的筛选

以大豆(海系13×北农103)F4RHL的F2分离群体为分析材料，从中各选取6个髙秆单株和6个 矮秆单株，采用BSA法，建立高秆和矮秆2个近等基因池，利用大豆630对SSR引物进行PCR扩增，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中，分析筛选2个近等基因池间具有多态性的SSR引物。经多次PCR筛选，在630对SSR引物中，获得25对具有多态性的引物，占总引物的4%，扩增产物表现出2～3条电泳谱带，在150～300 bp之间。在此基础上，利用RHLF2高矮秆分离材料中的30个髙秆和30个矮秆单株，继续对25对引物的扩增结果进行验证，发现在25对引物中，9个引物所产生标记与GmD1具有连锁关系，分别为Satt527，Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664。为进一步分析这9对引物产生的标记与GmD1的连锁距离，以(海系13×北农103)RHLF2分离群体共201个单株进行PCR检测，其中高秆139个，矮秆62个。检测结果表明，9个SSR引物(表1)扩增产生标记均与矮秆基因GmD1紧密连锁(表2)，其中3对引物的PCR结果见图2。

表1 SSR引物序列Tab.1 The SSR primer for analysis

表2 9个SSR标记对(海系13×北农103)RHLF2的检测结果和与GmD1的遗传距离Tab.2 Analysised results of HaiXi13×BeiNong103 RHLF2 by 9 SSR markers and genetic distance of GmD1

注：A为高秆纯合型；B为矮秆纯合型；H为杂合带型。

Note：A is high plant homozygous genotype; B is dwarf plant homozygous genotype; H is heterozygous genotype.

注：M是标记，1是海系13，2 是北农103，3-17是矮秆单株，18-32是高秆单株；箭头指示标记位置。Note: M is Maker, 1 is Haixi13, 2 is BeiNong103, 3-17 are Dwarf individuals, 18-32 are High individuals; The arrows indicated the SSR markers .图2 标记Satt481(A)、Sat_245(B)和Sat_150(C)的PCR结果Fig.2 PCR bySatt481(A), Sat_245(B) and Sat_150(C)

2.3 GmD1基因遗传连锁图谱的构建

利用Mapmaker3.0连锁分析软件对表1中的9对SSR引物在(海系13×北农103)RHLF2分离群体中的201个单株所产生的分子标记与矮秆基因GmD1进行连锁分析，并绘制遗传连锁图谱。结果表明：SSR标记Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664与GmD1的遗传距离分别为3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM，从遗传连锁图谱(图3)上可以看出GmD1位于satt166与satt527之间，与9个标记的连锁位置为Satt664-Satt229-Sat_245-Sat_150-Satt481-Sat_340-Satt527-GmD1-Satt166-Satt076。通过对公布的大豆遗传连锁图谱(www.soybase.org)上SSR位点分析，这9个SSR标记均在大豆L连锁群上，故GmD1基因也在L连锁群上，对应大豆第19号染色体。

3 讨 论

本研究利用(海系13×北农103)F4RHL的F2髙秆和矮秆植株构建的分离群体，对其矮秆植株携带的矮秆基因进行遗传分析。矮秆性状受1对隐性基因控制，暂命名为GmD1。进而利用SSR分子标记结合BSA方法对GmD1进行遗传连锁分析，筛选出9个与GmD1连锁的SSR标记，分别为Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664，经Mapmaker3.0软件连锁分析，与GmD1的遗传距离分别为3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM。依据公布的大豆遗传连锁图谱上SSR标记位点分析，GmD1位于大豆L连锁群上，对应大豆第19号染色体。

图3 大豆矮秆基因GmD1遗传连锁图Fig.3 Genetic linkage map of soybean dwarf gene GmD1

通过对海系13×北农103杂交组合的亲本株高的表现和系谱分析，GmD1来源于北农103，而北农103从中黄18种子60Co-γ辐照的衍生后代选育而成，中黄18的杂交组合为中品661×Century-2。Li等[13]用EMS诱变大豆品种中品661，得到1个能明显降低株高和缩短茎节尖的DW突变体，认为该突变体是由1对隐性核基因控制，定位在大豆8号染色体的460 kb区域。本研究发现该突变体基因与本研究发现的GmD1不在同一连锁群(染色体)上，并非同一基因。推测GmD1可能是一个新的矮秆基因。

尽管目前关于大豆矮秆基因的研究有所报道，但发现的矮秆基因依然较少，本研究对GmD1的发现，丰富大豆矮秆基因的类型，同时获得多个与GmD1紧密连锁的分子标记，为该基因的精细定位和利用奠定基础。