一种利用流式细胞仪快速检测植物倍性的分析方法

董馨忆

（昆明医科大学科研实验中心，云南 昆明 650000）

在研究植物的过程中，往往要对其生长发育和基因等因素进行检测研究，其中，对植物的基因组大小以及其DNA倍性的研究对该植物的品系、性状及营养和药用价值等都有着极其密切的关联。特别是在植物遗传育种中，植物染色体倍性鉴定是不可缺少的步骤，有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用的基础。在植物研究中，检测植物的基因组大小和DNA倍性是有非常重要意义的。

除细菌和蓝藻的细胞以外，所有的动物细胞以及植物细胞都属于真核细胞。研究表明包括植物细胞在内的真核生物的细胞增殖主要都是通过有丝分裂的方式。我们首先要知道，细胞有丝分裂的一个循环被称为细胞周期，它指细胞从上一次分裂结束到下一次分裂结束所完成的活动过程。整个周期被人为的分为：有丝分裂期（M）、有丝分裂后间期（G1）、DNA合成期（S）和合成后间期（G2）[1]。另外，除了有丝分裂这个增殖的周期之外，在许多双子叶植物的发育过程中，组织细胞也会受到一些其他的发育信号以及环境因素的影响，在S期完成后会直接重新回到Gl期开始新一轮的DNA复制，这个过程是跳过了G2和M期的，经过如此特殊的一个循环，就可以促使植物形成多倍体细胞，而在植物育种过程研究中，多倍体育种是特别重要的途径之一，它不仅可以对植物的性状进行改良，还可以提高植物体内各种有效成分的含量。这种特殊的导致多倍体形成的细胞周期在双子叶植物的叶、下胚轴、花器官和果实等器官的发育过程中是普遍存在的，而且这还与该植物细胞的扩展、分化密切相关。

正是因为对植物倍性的有效鉴定是了解其遗传背景和进一步研究的基础，所以我们才要找到并利用有效且快速的倍性鉴定方法，才能够准确地辨认多倍体并将其挑选出来。

流式细胞仪（Flow cy tometry ，简称FCM，是一种可以对动植物细胞或者一些微粒进行自动分析和分选的仪器。该仪器运用了激光技术和光电测量技术，并将计算机技术和流体力学结合起来，以细胞免疫荧光化学技术为基础，逐渐发展成为现代分子生物学实验室不可或缺的高科技细胞分析技术。由于流式细胞仪在检测细胞的大小、内部结构、DNA含量、特异蛋白质含量以及表面抗原等参数的优势，所以其现在也已广泛应用在植物遗传学，植物生理学等多个领域[2]。本实验旨在寻求植物DNA倍性分析的高效快速的一个检测方法。如果操作得当，那么流式细胞仪完全可以可在半小时内完成样本制备及染色并检测植物DNA倍性的全过程，如此方便快捷的方法，应该是值得推广应用的。

流式细胞仪检测植物倍性，主要以检测其DNA含量为基础。在检测植物细胞的周期实验中，G1期的细胞为二倍体，其DNA含量我们将其表示为2D（这里我们用“D”表示单倍体核的DNA含量），在S期DNA完成复制之后后，细胞就会变为四倍体，此时DNA含量为4D。植物细胞与动物细胞不同，在许多植物器官生长发育过程中，很多时候都是经历了跳过G2和M期的特殊循环，这样特殊的方式伴随细胞的扩展和分化，细胞由有丝分裂进入内复制，就会使植物细胞的倍性呈指数的增长，不仅仅只有2D、4D，甚至是会增加至8D、16D，乃至到32D或者更高，在二倍体与四倍体区域以外的统称异倍体[3]。利用分析型流式细胞仪，就可以精确地测定细胞内DNA的含量，以此快速准确的判断其倍性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验中使用的流式细胞仪是德国partec，其型号是CyFlow® Space，DAPI荧光染料也同样购自德国partec。4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI），是一种标记细胞DNA的染料，可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。DAPI与双链DNA结合时，荧光强度增强200倍，而与单链DNA结合时无荧光增强，与RNA结合不会形成强荧光，明显弱于DNA[4]，染色前无需用RNase处理细胞。

1.2 样品的采集、保存和处理

试验中所用的植物为马铃薯嫩叶，已经过前期处理。并对新鲜样品的保存条件、保存时间、制取方法等进行了摸索和优化。

加入DPAI荧光染料之前一定要用过滤网（至少300目）过滤，不少于2遍。留取至少1mL滤液备用。将滤液放入离心机，室温下离心5min，1500rpm。弃上清，加入1mL超纯水混匀，室温下离心5min，1500rpm，弃上清，备用。

1.3 样品的染色

每管样品中加入1mLDAPI，充分混匀。上样前再次过滤，300目。将制备好的细胞悬液充分混匀，转至3.5mL专用流式管中，备用。

1.4 上机检测

开机，根据DAPI染料，选择使用UV激发光。调整好对应的接收通道、合适的进样速度之后，将染色好的样品逐一检测。

样品检测之前要以每种植物的已知二倍体为对照，以它为标准，给待测样本DNA的含量提供一个对照。对照样本的所有处理过程要以其他样品一致。

调节FL9通道的电压值，将已知二倍体样品的荧光峰即G1期峰调至荧光道数为100处，收集信号，等到收集细胞数量达到20000后取下样品，保持该电压不动，逐一上样，收集每管样品细胞大约在10000～20000即可取下样品，记录该样品DNA峰型位置并将其保存好。测样结束后用专用清洗剂清洗管道之后再用超纯水清洗即可关机。

2 流式检测植物倍性的参数设置

2.1 参数的选择与调节

在德国partec CyFlow® Space型流式细胞仪所用的软件界面， 根据DAPI染料的接收通道，选用第一张图为FL9-A／FL9-W双参数散点图。横轴为FL9-A，纵轴为FL9-W。这是一个采用了面积信号和宽度信号共同体现的散点图，选用该散点图是为了通过调节FL9-A和FL9-W的光电倍增管电压，从该散点图上选定目标细胞进行下一步的分析，如下图（图1）所示，圈起来的表示R1的这部分细胞即为我们所要分析的细胞，其余细胞碎片、杂质和一些黏连细胞就可以被不在分析的范围内，这样可以使结果更为准确可靠。

根据图1中的R1细胞群，我们选择使用第二张图为横坐标为FL9的单参数直方图，如下图（图2）所示：在横坐标的100和200的位置分别出现了两个高尖峰，该图为一个典型的二倍体。

3 结语

我们可以看到，利用流式细胞仪检测植物细胞倍性的结果是十分明显的，而且也比较可靠。经过流式细胞仪对大量的处于分裂间期的植物细胞DNA含量进行检测，然后经其计算机软件系统自动统计分析后形成的非常直观的DNA含量的分布曲线图，我们就能看到已知的二倍体、四倍体的峰型，然后稳定其检测电压不变，用已知样本来比对位置样本，在流式细胞仪极其快速的检测过程中，一分钟之内即可快速的得到每一个样本的倍性，其结果稳定、直观、可靠、快速，不失为一种有效地检测方法，值得我们大力的推广使用。而且该方法取材部位多种多样，不仅仅可以是叶片，还可以是植物的根茎、花、果皮和种子等等，完全不受植物的取材部位和细胞所处时期限制，这点是优于其他检测方法的，例如需要取根尖才能检测的常规压片法，必须取卷须的去壁低渗法等等。只是该方法一定要依靠一个专业的实验室，配备相应的仪器，即使是一台简单的只有488激光器的最常规的流式细胞仪也比较昂贵，并且需要专业的仪器维护人员和专业熟练的操作才能得到真实可靠的结果，这也是制约了该技术发展的一个重要原因。笔者也希望在将来能够将流式细胞仪技术更多的运用和发展，使之成为一项简单且操作性强的仪器，使更多的实验者了解和认知，才能更有力的推广使用。