液质联用法测定水产品中氯霉素残留的技术研究

曾 智 朱志强 易 鸣

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液质联用法测定水产品中氯霉素残留的技术研究

曾 智 朱志强 易 鸣

氯霉素（Chloroamphenicol，CAP）是一种有效的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗，对多种病原菌有较强的抑制作用，人们经常使用氯霉素进行水体消毒和防治渔业病虫害，但由于氯霉素对人体产生严重的毒副作用，是多个国家禁止使用的兽用药物。目前水产品中氯霉素的残留主要用GB/T20756-2006国家标准进行检测，本文在此标准的基础上进一步优化了前处理方法，提高了检测效率，并且能够达到规定的重现性和准确性。具体通过液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/ MS），多反应监测扫描模式（MRM）和同位素内标法定量，直接对草鱼、鳜鱼、对虾等水产品中的氯霉素进行了检测。

一、实验材料

1.仪器

AB QTRAP4500液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）、匀浆机、离心机、超声波清洗仪、垂直振荡器、氮吹仪等。

2.材料

草鱼、鳜鱼、对虾等水产品，均采自于养殖场和农贸市场，去皮去骨去内脏取可食部分切碎、混匀、冷冻，作为样品备用。

3.试剂和药品

甲醇（色谱纯）德国Merck（默克）公司；乙酸乙酯（分析纯）、正己烷（分析纯）、氢氧化铵（25%-28%）（分析纯）国药集团。

表1 梯度洗脱液比例

表2 氯霉素（CAP）和氘代氯霉素（CAP-D5）的质谱参数

4.标准品

氯霉素（CAP）标准品德国Dr公司、氘代氯霉素（CAP-D5）BESTOWN北京振翔科技有限公司。

表3 标准工作曲线

二、实验仪器方法

1.色谱条件

色谱柱：Thermo C18柱（1.9μm×2.1mm ×50mm）；柱温40℃；进样量10.0μL；流动相乙腈和水，流速0.4mL/min，运行时间6min。

2.质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，多反应监测扫描模式（MRM）；雾化器、碰撞器为氮气。质谱参数见表2。

三、实验步骤

1.标准溶液的配置

氯霉素标准储备液（100.0μg/mL）用甲醇配置，氯霉素标准中间工作液（40.0ng/mL）用水稀释；氘代氯霉素标准使用液（20.0ng/mL）用水稀释。

准确量取一定量的氯霉素标准中间工作液，用水稀释成浓度为0.10ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/ mL、3.50ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL的标准系列使用液，氘代氯霉素的浓度均为1.50ng/mL。

2.样品前处理

样品的前处理过程比较重要，直接影响检测结果，提取步骤如下：准确称量5.00g匀浆样品，置于50mL离心管中，加入20ng/mL的内标标准溶液75.0μL，加入15mL乙酸乙酯，0.4mL氢氧化铵，垂直振荡1min，4500转离心5min，取上清液至另一50mL离心管中，重复提取一次，合并提取液，混匀。取10mL提取液40℃氮吹吹干，加入1.0mL水涡旋，再加入2mL正己烷涡旋30秒，4500转离心5min，弃去上清液，样液经0.22μm有机滤膜过滤后，待上机分析。

3.样品加标回收率的测定

准确称取氯霉素的阴性样品5.00g，添加浓度为40.0ng/mL的氯霉素使用液12.5μL、62.5μL、87.5μL共3组，加入浓度为20.0ng/mL的内标标准溶液75.0μL，每组5个平行样。

表4 氯霉素的添加浓度及其平均回收率的实验数据（n=5）

四、结果与讨论

1.氯霉素的标准工作曲线

按上述色谱和质谱条件测定一系列6个质量浓度的氯霉素的标准曲线，以标准物质的质量浓度与内标物的质量浓度之比为横坐标，标准物质的峰面积与内标物的峰面积之比为纵坐标，绘制标准工作曲线（见表3），线性范围为0.25-5.00ng/mL，线性方程为y=0.45422x+0.01047，线性相关系数为0.99993，定量限为0.10μg/kg，在以实验所取的0.10-10.00ng/mL之间的8个点做线性回归时，当用10.00ng/mL作为标准曲线的最大浓度时，低浓度的点偏差较大，高于实际浓度的50%左右，所以该线性关系不适用于氯霉素含量高的水产品检测。

2.不同水产品中氯霉素含量的检测结果（见表4）

氯霉素检测的线性范围为0.25-5.00ng/mL，定量限为0.10μg/kg，在加标量为0.10μg/kg、0.50μg/kg、1.00μg/kg时，样品加标回收率均在80%-120%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10.0%。

3.结论

目前水产品中氯霉素的残留主要按照国家标准GB/T20756-2006进行检测，此方法在实际操作中操作步骤较为繁琐，前处理时间较长，且存在一定的污染风险。本实验优化了前处理方法，用氮吹取代旋蒸，同时简化操作步骤，节省操作时间，且检测结果均能满足检测要求，提高了检测效率，但本实验方法也有一定局限性，当样品中氯霉素含量超过1μg/kg时，线性要求可能无法满足，此时我们可以通过减少取样量或增加内标液的加入量等方法进行改善。综上所述，我们在液质联用法测定水产品中氯霉素残留时，应根据自己的实际情况和需求来选择适当的前处理方法，已达到较好的检测效果。

（通联：430070，农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心·武汉 电话：13971303160）