碱性蛋白酶产生菌培养分离和酶活力测定

段毓佳 鲁良 石达 毛爽

摘 要：筛选出4种可以产生碱性蛋白酶的菌株，分别编号1，2，3，4，通过菌株的生长情况，菌落的特征等这4种菌株进行分离，进步的纯化，制备酶活力测定的标准曲线。4种菌株在25℃条件下，酶活力有大有小，最大的为168um/min左右，最小酶活力在21um/min左右。

关键词：碱性蛋白酶；培养；分离；酶活力

碱性蛋白酶是指PH在9-11的碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶类，由于其活性中心含Ser，故属于丝氨酸蛋白酶。有数据显示，全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元，在所有的工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。碱性蛋白酶在食品，洗涤、丝绸、饲料、医药、环保以及制革等行业中，有着广泛的用途，因此具有很强工业与经济价值。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快捷，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性，有一定的酯酶活力。因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点。

一、实验

1.菌株及其培养基。菌株的获得：从邢台学院餐厅附近的垃圾池旁收集土壤。牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨10g，NaCl5g，1000ml水，PH值7.4-7.6； 酪蛋白培养基：酪蛋白2.5g，酵母膏5g，琼脂10g，500ml水，PH 值9.0；

种子培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨5 g，酵母膏2.5g，NaCl2.5g，500ml水，PH 值9.0；发酵培养基： 葡萄糖2.5g，蛋白胨5 g，酵母膏25g， K2HPO4 5g，MnSO4 20g，500ml水，PH 值9.0。

2.仪器。三角瓶，高压灭菌锅，培养皿，试管，酒精灯，烧杯，电炉，滤纸，漏斗，玻璃棒，生化恒温培养箱，震荡培养箱，电子天平，722型可见分光光度计。

3.方法

（1）菌株的培养 。将少量取样的土壤加入无菌水进行稀释，混匀，静置，之后再进行取少量上层清液分别稀释100倍，用滴管吸取少量的稀释液在酪蛋白培养上滴加一滴，然后用玻璃环在培养基上涂布，25℃恒温培养48h。挑取产生透明圈的菌株在酪蛋白培养中进一步纯化，同时进行平板划线25℃培养，和接种到斜面培养基保存。根据平板划线菌株生长的情况，选取适宜的菌株进行振荡培养。分别挑取平板划线培养基上的菌，接种到种子培养基上进行震荡培养48h。

（2）菌株的分离。将经纯化分离得到的菌株，点种于酪蛋白培养基中，进行初步酶活力测定，根据点种菌株的情况，分别记录4种菌株的情况。

（3） 菌株产生酶的活力测定。 将分离得到的适宜菌株接种到100ml左右种子培养基中，28℃振荡培养24h，以5%的接种量接种到发酵培养基28℃振荡培养48h，发酵液3000r每分钟，离心15min，取上清液，采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。

（4）标准曲线的制定。取6支试管，标号按照下面的配比操作，加入5ml碳酸钠溶液及0.5mlFolin-酚试剂，迅速混匀，于40摄氏度恒温水浴中显色20min，取出后用流水冷却，在分光光度计上以1号管为对照测定各管的吸光度（A680），以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

二、结果和分析

1.菌株的筛选。经酪蛋白培养基培养后，在培养基上产生明显透明圈的只有4种菌株，将其编号为1，2，3，4号，据测量发现菌株2和3的D/d值比较大，同时也比较接近，而菌株1和4的D/d值比较小，菌株的比值最大。

2.菌株分类。菌体特征：表面褶皱，扁平而大白色；表面光滑，小也有突起淡黄色；表面相对光滑，高耸而大黄色；菌落边缘褶皱，高耸而大白色

3.菌株酶活力的测定。由多组数据点0.165，0.213，0.464，0.406，0.772等得出标准曲线的方程式：y=-0.036+0.0147x、25度下各菌株酶活力测定结果如下。

三、结论与讨论

从富含蛋白质的土壤中分离出来的4种菌株都具有产生碱性蛋白酶的能力，并对它们各自的菌落特征进行记录。经测定25度下各菌株酶活力，得知酶活力的强弱。通过实验可以获得酶活力比较高的菌株，但是还是不能满足工业等生产的实际应用。

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通讯作者：唐蕊（教授）