猪苓多糖脂质体的制备及表征

时间：2024-05-30

韩悦李早慧赵欣宇黄礼祥范靖琪

摘要：目的：旨在通过薄膜分散法-微孔滤膜挤压法制备脂质体，并对脂质体包封率、粒度分布、zeta电位进行检测。方法：主要通过单因素试验及正交试验筛选出最佳的制备工艺，且验证工艺的合理。脂质体利用薄膜分散法制备并测定包封率，考察脂质体的形态。结果：所制备出的猪苓多糖脂质体包封率较高，粒径均匀，显微镜下脂质体均匀圆整、近球形。

关键词：猪苓多糖;薄膜分散法;包封率

基金项目：吉林省大学生科技创新省级，项目号：2018012

中图分类号： TQ461 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.16.038

猪苓已有2000多年药用历史，是我国比较常用的菌类药材，在《神农本草经》等著作中都体现了其应用价值[1]。近些年研究发现，从中药材猪苓中分离出来的猪苓多糖，为植物型的免疫增强剂。可以有效地促进肝细胞再生和肝功能恢复，针对慢性乙型肝炎可促进表面抗体的产生，具有显著的治疗效果[2]。目前市面上常见的猪苓多糖剂型为胶囊剂及颗粒剂。这些传统剂型虽然有一定疗效，但在血液中停留时间短，药效低。

20世纪70年代首次将脂质体作为药物载体应用[3]，脂质体的结构使其具有靶向作用，可选择性地作用于细胞[4]，并具有低毒性和长效缓释性，引起了广大药剂学者的关注与研究[5、6]。

本课题突破传统的中药剂型，将猪苓多糖制备成脂质体，为治疗慢性乙型肝炎提供了新的剂型。其增加了药物与肝细胞的亲和力，有效提高了猪苓多糖在体内的吸收，从而增强治疗效果。同时，本课题的研究为脂质体的进一步研究提供了理论基础，对拓宽猪苓多糖脂质体的生产有着重要意义。

1仪器与材料

1.1实验材料

猪苓多糖，生理盐水，苯酚，浓硫酸，卵磷脂，胆固醇，无水乙醇，甲醇，氯仿，磷酸盐缓冲液，微孔滤膜，葡萄糖对照品，蒸馏水。

1.2实验仪器

紫外分光光度仪，分析天平，旋转蒸发仪，离心机，电子显微镜，激光散射粒度仪。

2项目实施方案

2.1载药脂质体的制备

采用薄膜分散法-微孔滤膜挤压法[7～8]，在圆底烧瓶中，将卵磷脂，胆固醇与氯仿、甲醇混合，混合均匀后放置到旋转蒸发仪上减压蒸发[9]，除去氯仿及甲醇，形成一层薄膜。在磷酸盐缓冲液中加入适量的猪苓多糖，并倒入圆底烧瓶中，可形成大多层脂质体，再通过微孔滤膜即得[10]。

2.2正交试验筛选出最佳制备工艺

2.2.1单因素试验在试验过程中以包封率作为评价指标，通过对比在生产过程中各单因素对制备工艺的影响，从而确定出最佳方案。

制备温度的选择：水浴温度的差异在制备过程中会影响磷脂的溶解以及膜材成膜性，进而对脂质体的稳定性造成一定的影响。在保证其他药品和试剂用量不变的条件下，将水浴温度改变，考察包封率在不同制备温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的变化程度。当40℃制备温度时，脂质体的包封率达到最大值，继续升温后，磷脂不稳定，包封率呈下降趋势，所以应选择温度为40℃。

氯仿和甲醇比例的确定：有机相的选择是稳定脂质体溶液制备的关键，比例的变化对脂质体包封率会产生影响。考察氯仿和甲醇的比例1∶3、1∶2、1∶1、2∶1对包封率的影响，其比例为2∶1时包封率32.25%最优，将氯仿与甲醇的比例设为2∶1。

卵磷脂与胆固醇质量比的确定：胆固醇对卵磷脂凝聚结构有调节作用，随着质量比的比例变化，包封率也会随之变化。考察包封率在磷脂与胆固醇的比例为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1时变化程度，不同的磷脂与胆固醇的比例对包封率的影响较大，在6∶1比例条件下包封率较高。

药物与卵磷脂质量比的确定：不同的药脂比例会影响脂质体的包封率，试验中保持其他条件不变，来调整药脂比例。考察不同药脂比对1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5对包封率的影响，在1∶10比例下包封率达到最大值35.64%。

2.2.2正交试验考察制剂温度、氯仿与甲醇比例、磷脂与胆固醇的比例、药脂比对脂质体成型影响较大的因素，选用正交表L9（34）进行正交试验（见表1）。

通过上述正交试验可知，脂质体处方中影响因素从大到小分别是A>C>D>B，选择的最优处方为A2、B3、C1、D3，即本实验最终选择制备温度为40℃，0.2g卵磷脂，0.04g膽固醇，0.02g猪苓多糖，氯仿甲醇比例为2∶1，进行脂质体的制备（见表3）。

2.2.3验证试验重新制备了三批脂质体并根据上述最佳的配比结果，进行试验。把测得的包封率与表2试验模型进行对照，结果基本一致，表明此工艺稳定可行。

2.3载药脂质体包封率的测定

2.3.1空白脂质体的制备采用薄膜分散法-微孔滤膜挤压法，在圆底烧瓶中，将0.2g卵磷脂，0.04g胆固醇与氯仿、甲醇（比例为2∶1）混合，混合均匀后放置旋转蒸发仪上减压蒸发，除去氯仿及甲醇，形成一层薄膜。将磷酸盐缓冲液中倒入圆底烧瓶中，可形成大多层脂质体，再通过微孔滤膜即得。

2.3.2 检测波长的确定用仪器精密吸取2ml，浓度为50mg/mL的葡萄糖对照品溶液，用水作为空白对照，采用苯酚-硫酸法，在200～800nm的波长处进行扫描。另取空白脂质体2mL，根据上述流程操作。最终选择检测波长为470nm，此时的波长可以使对照品溶液出现最大吸光度，并对空白脂质体无干扰性，减小误差。

2.3.3标准曲线的绘制将葡萄糖对照品配制成浓度0.1mg/mL的对照品溶液。加入不同体积的葡萄糖对照品溶液（0.3mL～1.2mL）于带塞试管中，加蒸馏水至2mL。利用苯酚-浓硫酸法测定不同体积对照品溶液的吸光度，得到回归方程为y=0.042x+0.0394，r=0.9998。结论表明：葡萄糖在4.01μg/ml～13.38μg/ml 有着良好的线性关系。

2.3.4高速离心法测定包封率在100mL容量瓶中放入载药脂质体1mL，定容。用空白脂质体进行空白对照试验，分别取载药脂质体和空白脂质体各1.5mL，采用苯酚-硫酸法，在470nm波长处进行吸光度值的测定，用标准曲线方程计算脂质体中猪苓多糖的含量。在离心管中加入脂质体混悬液2mL，离心速度10000r/min，离心20min。用吸管取上清液1mL，定容，利用苯酚-浓硫酸法测定总多糖含量，计算求得包封率〔（W总-W游_/W脂质体×100%〕为（38.37±0.02）%。 2.3.5穩定性试验将脂质体分别放在温度为4℃以及室温下（20℃），在4℃时外观均匀，无沉淀及分层现象;在20℃下放置3个月后时出现分层现象。由上述现象可知：4℃时脂质体稳定性较好。

2.3.6精密度试验取对照品溶液稀释，共配制5份同样的稀释液，在配制后6h内测定6次，记录其吸光度，最终计算出其RSD值为1.6%<2%，说明其在6h内稳定性良好。

2.4脂质体粒径及电位的检测

将脂质体放入显微镜下观察，其形态如图所示（图略）。利用激光散射粒度仪进行脂质体检测。结果表明，脂质体呈正态分布，粒径为（115.6±5）nm，Zeta电位为（-25.8±0.56）mV。

3结论

猪苓多糖是很有价值的提取成分，在对肝组织病理损伤的治疗上有着显著作用。目前，我国对猪苓多糖的研究和应用还应该增加广度和深度，多进行开发利用，其作用可以更好的发挥。

本课题采用薄膜分散法进行猪苓多糖脂质体的制备，并对其制备工艺进行优化。以包封率作为试验的评价指标，采用单因素法进行对比各因素对制备工艺环节的影响，正交试验设计出最佳的制备工艺，对脂质体的制备处方进一步优化。综上所述：制备温度为40℃，0.2g卵磷脂，0.04g胆固醇，0.02g猪苓多糖，氯仿甲醇比例为2∶1，验证试验证明了工艺的稳定性和可行性。试验最终制备出的脂质体稀释后呈淡蓝色乳光，形态为球形或类球形。包封率较好，稳定性考察良好，适合在4℃条件下存放。

本试验的结果可为猪苓多糖的下一步研究提供参考，具有一定的研究及推广价值。

参考文献

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