长白山野生蓝莓中还原型谷胱甘肽含量的测定

朴泓洁，李铉军

（延边大学农学院，吉林延吉133000）

长白山野生蓝莓中还原型谷胱甘肽含量的测定

朴泓洁，李铉军*

（延边大学农学院，吉林延吉133000）

为了解长白山野生蓝莓中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量。本研究利用5，5-二疏基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）衍生化法进行了定量分析。得出蓝莓中GSH的含量为1.0977±0.0264毫升/克。每克蓝莓粉末中GSH的含量达到0.8395毫升/克。

DTNB；蓝莓；GSH

谷胱甘肽（L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，Glutathione）是一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物，作为生物体内的非蛋白巯基化合物，谷胱甘肽主要有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态，在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽。临床上，谷胱甘肽可以迅速提高机体免疫力，在抗氧化、抗辐射、清除自由基、解毒、促进铁质吸收等方面具有良好的效果且无副作用；在食品加工领域，谷胱甘肽具有增强食品营养价值和强化食品风味等功能。科学家们一直研究它在各种生物体内的生理作用，其中GSH在人体各种组织细胞中的含量以及与各种疾病、组织损伤的关系至今仍然是研究的热点[1-2]。蓝莓，又称笃斯、越橘，俗称都柿，为杜鹃花科越橘属野生落叶灌木，其果实为浆果，成熟后为蓝紫色，球形或椭圆形，果皮有白霜。蓝莓的果味鲜美、营养丰富，英国权威营养学家将蓝莓列为15种健康食品之首，联合国粮农组织也将蓝莓列为人类五大健康食品之一[3]。

本研究采用DTNB作为GSH的衍生化试剂进行超声波细胞破壁，这种操作可以对蓝莓粉末破壁的同时又可以给衍生化试剂充分的反应时间进行衍生化反应而生成稳定的GSH衍生化产物[4]。其目的是利用衍生化试剂所进行的化反应来避免巯基化合物从细胞内流出时而被外界的其他化学环境破坏，从而生成稳定的产物，利用其产物的颜色来进行分光光度分析而得到样品中的GSH含量及定性信息[5]。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器

1.1.1 材料 蓝莓购于延吉市千盛超市。

1.1.2 试剂与药品 5，5-二疏基 -2，2-二硝基苯甲酸/DTNB、还原型谷胱甘肽、磷酸氢二钠、氢氧化钠、石油醚、海砂。

1.1.3 实验仪器 JA-3100精密电子天平（深美仪器有限公司）；FA1004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；CX-100高速多功能粉碎机（上海市晟喜制药机械有限公司）；DHG-907385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；KQ-500DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-5000B冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；PHS-3CpH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；

UV-1800紫外 /可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；SJ-2028R榨汁机（佛山市顺德区金宜美电器有限公司）；80目网筛；索氏提取器。

1.2 实验方法

1.2.1 预处理工艺流程 蓝莓→清洗→挑选（无虫害、无病变）→榨汁→烘干（50℃）→粉碎→过筛（80目）→脱脂→低温保存待用。

1.2.2 预处理 在延吉市千盛超市购买今年新生长白山野生蓝莓，进行清洗后选择充实饱满无病害的蓝莓，放入榨汁机中制成浆状蓝莓，取洁净的称量瓶，加 10克海砂及一根小玻棒，置于50℃干燥箱中，干燥 1.0小时后取出，放入干燥器内冷却0.5小时后称量，并重复干燥至恒重。然后称取 5～10克试样（精确至 0.0001克），置于蒸发皿中，用小玻棒搅匀放在沸水浴上蒸干，并随时搅拌，擦去皿底的水滴，置 50℃干燥箱中干燥4小时后盖好取出，放入干燥器内冷却 0.5小时后称量、保存，再用索式提取器对蓝莓进行脱脂，脱脂时间为大约 12小时左右，脱脂处理后把蓝莓放入干燥箱内挥发掉其中的石油醚，大约需要0.5小时，剥去海沙，最后放入低温条件下，以保存待用[7]。

1.2.3 DTNB衍生化分光光度法 GSH的定量分析原理是利用5，5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)衍生化试剂和植物材料同步破壁提取的样品处理方法，采用分光光度法对枸杞中还原型谷胱甘肽(GSH)进行定性、定量分析。蓝莓样品提取过程中GSH受破壁后胞外化学环境的影响导致氧化变性。利用5，5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)衍生化试剂同步提取，因生成稳定的GSH的衍生化产物避免了GSH氧化变性导致的GSH分析信息丢失。用分光光度法测定 GSH含量，发现蓝莓中含有丰富的GSH。

GSH的定量分析原理是利用DTNB在pH值为7环境中与巯基发生反应，生成 3-羧基-4-硝基苯硫酚，其离子呈黄色而且在波长409nm处有强烈的吸收峰，并且该吸收峰在过量的DTNB的溶液下其吸光度值与加入的GSH量呈良好的线性关系[6-7]。

标准曲线的制定：分别在6个试管中分别加入（0毫升，0.2毫升，0.4毫升，0.6毫升，0.8毫升，1.0毫升）2× 10-4mol/L的 GSH溶液，然后分别对应在 6个不同浓度梯度的试管中分别加入 25毫升（20mlDTNB+5mlPBS）含有2× 10-4mol/LDTNB溶液和pH值为 7.00的PBS缓冲液，充分混匀后，等待 10分钟，再调节 pH至 7.00在409nm下确定存在强吸收峰的λ值，并绘制标准曲线。

GSH含量测定的具体操作方法：取 25毫升（20mlDTNB+5mlPBS）含有2×10-4mol/LDTNB溶液和pH为7.00的 PBS缓冲液作为提取液，在提取液中加入 0.25克蓝莓粉末，充分混匀后放入超声波机中进行震荡破壁，工艺条件：500W，30分钟。然后把提取液倒入离心管中进行离心（6000r/min10min），离心后取出 10毫升上清液，加入其 2倍体积无水乙醇溶液，然后静置 30分钟，在 5000转 /分钟转速下离心10分钟除蛋白，倒出上清液，调节酸碱度为 pH为 7.00，用分光光度计测定其吸光值，采用标准曲线法对实验样品中的GSH进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 GSH标准曲线的制定

疏基与DTNB更适合在pH=7.00溶液中反应后在409nm处测定。且实验中GSH的定量分析的原理是根据疏基与DTNB在pH为7.00的环境中发生反应，生成3-羧基-4-硝基苯硫酚，其3-羧基-4-硝基苯硫酚溶液中离子的颜色为黄色且在波长409nm处具有强烈吸收峰值。从而可以得出在pH为7.00时的线性回归方程为y=0.0354x+0.0236R2=0.9922。

2.2 GSH的含量分析

根据图1，在 pH为7.00时的线性回归方程为 y=0.0354 +0.0236R2=0.9922根据表1平均值 0.149，得出 x=3.5424

图1 GSH的标准曲线

表1 样品在409nm下吸光值含量的分析

根据计算公式m=M×n

M-溶质的摩尔质量

n-样品中GSH的物质的量

m-样品中GSH的质量

由上可知在pH为7.00的环境下可测得蓝莓样液中GSH的物质的量为 2.88×10-5mol，从而可以推算出蓝莓样品中还原性谷胱甘肽的含量为（1.0977±0.0264）mg/g。每克蓝莓粉末中GSH的含量达到0.8395毫克 /克蓝莓中的还原性谷胱甘肽含量里处于植物中等水平。

3 结果与讨论

DTNB衍生化法是在对长白山野生蓝莓粉末细胞破碎的同时衍生化反应也在进行，这样可以使GSH不易被外界其他的环境所影响变性，使反应产物更加稳定，测定结果的数据更加准确。在 pH为 7.00的条件下，疏基与 DTNB反应后在409nm有强吸收峰，在此光度下分析得出长白山野生蓝莓中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量 1.0977±0.0264毫克 /克，每克蓝莓粉末中GSH的含量达到0.8395毫克/克。

我省长白山地区有丰富的野生蓝莓资源，本研究为长白山野生蓝莓资源的进一步开发提供了一定的理论依据。

[1]蔡俊.谷胱甘肽的研究进展[J].粮食与饲料工业,2000 (10):41-42.

[2]刘超，袁建国，李峰.谷胱甘肽国内外研究进展[J].山东食品发酵,2010(04):7-10.

[3]聂飞,韦吉梅,文光琴.蓝莓的经济价值及其在我国产业化发展的前景探讨[J].贵州农业科学,2007,35(01):117-119.

[4]刘国琴,陈洁,赵雷,等.小麦胚芽中谷胱甘肽提取方法探讨及工艺条件优化 [J].河南工业大学学报自然科学版. 2007,28(02):l-5.

[5]周惠明，朱科学.小麦胚中谷胱甘肽的纯化与富集的研究[J].中国粮报,2003,18(01):17-20

[6]中华人民共和国卫生部.GB 5009.3-2010食品中水分的测定[S].北京:中国标准出版社,2004.

[7]周楠迪,李寅,陈坚,等.从酵母中提取谷胱甘肽的初步研究［J］生物技术,1997(04):30-33.

TS255.7

A

10.14025/j.cnki.jlny.2016.21.030

朴泓洁，延边大学农学院，在读本科生，研究方向：食品分析。

李铉军，朝鲜族，硕士，延边大学农学院，讲师，研究方向：食品分析。