β—甘露聚糖酶基因的克隆及原核表达载体的构建

张云晖　关珍贞　王霞

摘要：目的：克隆β-甘露聚糖酶基因并构建其原核表达载体。方法：提取地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组，PCR法扩增该菌基因组中的β-甘露聚糖酶基因，与表达载体pET-28a连接并转化到E.coli BL21中，构建原核表达载体，并对阳性重组菌进行PCR和酶切鉴定。结果：成功克隆β-甘露聚糖酶基因并构建其原核表达载体，β-甘露聚糖酶基因全长1008bp，编码336个氨基酸，蛋白质分子量约为38KDa。SDS-PAGE检测显示重组酶分子量约为38KDa。结论：成功构建β-甘露聚糖酶基因的原核表达载体为基因的重组表达奠定基础。

关键词：地衣芽孢杆菌；β-甘露聚糖酶基因；克隆；原核表达载体

项目基金：吉林农业科技学院校级微生物重点学科培育项目（编号：吉农院合字〔2013〕第X006 号）；大学生科技创新科研项目（编号：吉农院合字〔2009〕第112号）

中图分类号： Q943.2 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.11.023

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC.3.2.1.78）是一类半纤维素水解酶，能够催化甘露多糖（如半乳甘露聚糖、甘露聚糖等）的β-1，4甘露糖苷键随机水解，生成一系列低分子量的寡糖[1]。作为一种新型的酶制剂，β-甘露聚糖酶已经广泛应用于医药、食品、饲料、纺织、印染、洗涤、农业、造纸、石油开采及环境治理等诸多领域[2]。

对β-甘露聚糖酶的早期研究主要集中在产酶菌株的选育、提纯、发酵条件优化等方面，随着分子生物学技术的飞速发展，自20世纪90年代起，人们开始在分子水平上研究β-甘露聚糖酶，并迅速取得了丰硕的成果，目前已有多种微生物来源的β-甘露聚糖酶基因被分离、克隆，甚至实现异源表达[3，4]，但是关于地衣芽孢杆菌ATCC 14580 β-甘露聚糖酶基因的克隆及异源表达则尚无报导。本研究克隆了产地衣芽孢杆菌ATCC 14580 β-甘露聚糖酶基因，并构建其原核表达载体，为研究β-甘露聚糖酶的分子遗传学基础，开辟β-甘露聚糖酶工业化生产的新途径，提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与载体 地衣芽孢杆菌ATCC14580购自上海北诺生物科技有限公司，E.coli BL21为实验室保存，pMD18-T质粒购自宝生物工程（大连）有限公司，pET-28a质粒购自上海佳和生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 Bam HⅠ、HindⅢ、T4 DNA 连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker，均购自宝生物工程（大连）有限公司，IPTG购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯，培养基为常规LB培养基。

1.2方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶基因的克隆 参照精编分子生物学实验指南的方法提取地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组[5]。根据已报道的地衣芽孢杆菌ATCC 14580全基因组序列以及其它芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶基因序列，利用LaserGene软件寻找地衣芽孢杆菌ATCCC14580的β-甘露聚糖酶基因序列，并设计引物，引物中分别加入Bam HⅠ和HindⅢ（下划线部分）的酶切位点，引物序列分别：5'-GGATCCACACCGTT

TCTCCGGTG -AAC-3'，5'-AAGCTTCCACGA CAGGCGT。

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组为模板，扩增β-甘露聚糖酶基因。PCR反应体系为：94℃预热5分钟；94℃，45 秒，50℃，45秒，72℃，1分钟，30个循环；最后，72℃延伸10分钟。回收PCR产物并与pMD18-T载体连接，重组DNA转化至E.coli DH5α中，进行蓝白斑筛选，提取白色菌落质粒，送上海生物工程技术服务有限公司测序，同时进行PCR验证[6]。

1.2.2 β-man基因原核表达载体的构建 用BamHⅠ、HindⅢ分别双酶切pET-28a质粒和经验证正确的克隆基因，回收酶切后的大片段，用T4 DNA liganase连接，重组DNA命名为pET-28a-man，转化到E.coli BL21中，在含有卡那霉素的LB培养基中初筛阳性重组菌，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。

2 结果分析

2.1 β-man基因的克隆

PCR产物电泳结果如图1所示，扩增产物约为1008bp的基因片段，条带单一，特异性强，与预期1008bp大小一致。

2.2重组克隆质粒pMD18-T-man鉴定

测序结果表明该基因全长1008bp，DNA MAN 软件分析出该基因编码336个氨基酸，分子量约为38KDa。以初筛阳性重组菌质粒为模板，进行PCR扩增并电泳检测，结果如图2所示，PCR产物为大约1008bp的DNA片段，与预期大小一致，表明pMD18-T-man构建成功。

2.3 原核表达载体pET-28a-man鉴定

提取抗性初筛存活的E.coli BL21质粒，并以其为模板进行PCR鉴定，结果如图3所示，获得了大小约1008bp DNA片段，说明构建的重组载体中含有β-man基因。BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒并电泳检测，分别获得了一大一小两个DNA片段，大片段为5343bp的pET28a部分片段，小片段为克隆的β-man基因，说明原核表达载体pET-28a-man构建成功。

3 讨论

β-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，目前在动物、植物和微生物中都有发现，其中微生物是该酶的主要来源，也是工业化生产β-甘露聚糖酶的主要来源[7]。研究发现，β-甘露聚糖酶在原始菌株中一般分泌量比较低，提纯困难，因此，利用基因工程技术克隆β-甘露聚糖酶基因，并使之在大肠杆菌、酵母等细胞中高效稳定表达是该酶生产的有效途径[8]。本研究首次将地衣芽孢杆菌ATCC14580的β-甘露聚糖酶基因与原核表达载体pET-28a连接，并转入E.coli BL21中，成功构建了该基因的原核表达载体。后续将研究该基因在重组菌中的原核表达和酶学性质，并对其发酵条件进行优化，以期获得高产量、高品质β-甘露聚糖酶。

参考文献

[1]Schombug D， Salzmann M. Enzyme handbook（04） [M].Berlin：Springer Verlay Berlin Heideberg， 1991，1-5.

[2]李剑芳，邬敏辰，夏文水.微生物β-甘露聚糖酶的研究进展[J].江苏食品与发酵，2004，118（03）：4-9.

[3]Ma Y H， Xue Y F， Dou Y T， et al. Characterization and gene cloning of a novel β-mannanase from alkaliphilic Bacillus sp.

N16-5[J]. Extremophiles，2004，8（06）： 447-454.

[4]刘小丹，杨培龙，刘永超，等.一种来源于Paenibacillus sp.A1的中性β-甘露聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究[J].中国农业科技导报，2009，11（05）：60-65.

[5] F M·奥斯伯， R·布伦特， R E·金斯顿， 等. 精编分子生物学实验指南[M]. 北京： 科学出版社，1998.

[6]何冬兰，张莹，彭宝玉.重组谷氨酞胺转胺酶基因的原核表达研究[J]. 中南民族大学学报（自然科学版），2010，29（4）：32-36.

[7] Hasan F， Ali Shah A， Javed S， et al. Enzymes used in detergents： Lipases[J]. African Journal of Biotechnology， 2010，9（31）： 4836-4844.

[8]龚月生，刘锦妮，王晶.耐热尽半乳糖普酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（10）：59-65.

作者简介：张云晖，吉林农业科技学院，在读本科生，研究方向：分子生物学。

通讯作者：王霞，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：

分子生物学。