空气放电对尖孢镰刀菌的活力及其超微结构的影响

刘梦蝶+唐慧+李洁+严守雷+王清章

摘 要：采用空气放电技术对尖孢镰刀菌进行体外抑菌试验。试验结果表明，空气放电对菌丝生长和孢子萌发有显著的抑制作用（P<0.05），且抑制效果与处理时间呈正相关；通过扫描电镜和透射电镜观察，发现空气放电处理后的菌丝体干瘪褶皱且表面粗糙，外层结构不完整；菌丝细胞和孢子细胞形态不规则，细胞壁内陷或者突起，厚薄不均匀，其中孢子细胞内出现大量液泡且液泡体积较大，细胞质失去紧致结构；利用AO/EB荧光染料标记孢子细胞，结果显示空气放电处理显著促进孢子凋亡（P<0.05）。

关键词：空气放电；尖孢镰刀菌；抑制作用；超微结构

中图分类号：S477+.3 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）18-0147-05

莲藕是我国最重要的水生蔬菜，也是一种典型的经济作物[1]，全国栽培面积大，产量高。但由于莲藕组织含水量高、营养丰富，在贮藏期间容易发生腐败霉烂从而失去其商品价值。本实验室前期研究确认尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是造成莲藕采后腐败的优势病原菌之一[2]。

空气放电抑菌法是通过采用非均电场无声放电或电晕放电使空气电离产生放电生成气，主要是臭氧（ozone）和负离子（Negative air ions，NAI，包括O2-、H2O-、O3-等），使整个杀菌环境中保持一定浓度的放电生成气对微生物进行短期或长期处理，从而抑制菌丝生长、孢子萌发，破坏细胞壁和细胞膜组分与结构，阻碍病原菌物质代谢、呼吸代谢、能量代谢，进而诱导病原菌细胞凋亡。

利用空气放电生成气对尖孢镰刀菌进行体外抑菌试验，研究空气放电处理对尖孢镰刀菌菌丝和孢子的生长、凋亡及超微结构的影响，为空气放电抑制尖孢镰刀菌的机理研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

①菌种 尖孢镰刀菌（F. oxysporum）由本实验室对莲藕贮藏期病原菌进行分离保存。

②试剂 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：北京陆桥责任技术有限公司；AO/EB染料：上海贝博生物公司。

③仪器 臭氧变送器MIC-O3，负离子发生器XA-1：深圳市蓝月测控技术有限公司；扫描电镜：日本NTC公司；透射电镜：日本HITACHI公司；荧光显微镜：日本Olympus公司。

1.2 试验方法

①试验设计 F. oxysporum置于PDA平板上培养6 d后，在菌落边缘打出直径6 mm的菌饼移至新的PDA平板中央，当密闭空气放电设备内气体中ozone和NAI生成气达到设定浓度后，将样品放入ozone（浓度3 500 mg/m3）、NAI（浓度6×106 ions/cm3）、ozone+NAI同时处理（3 500 mg/m3+6×106 ions/cm3），处理时间分别为6、12、18、24、30、36 h，处理完毕后立即将平板倒置于26℃ 恒温培養箱中培养。每个处理重复3次，以不做任何处理为对照。

②抑菌率的测定 培养3 d后，用“十”字交叉法测定其菌落扩展直径，计算其抑菌率[3，4]。抑菌率（%）=（a-b）/a，a为对照菌落的平均直径，b为处理菌落的平均直径。

③孢子萌发抑制率的测定 培养6 d后，采用凹玻片法测孢子的萌发率[5]，将上述经不同处理

后的培养皿上的分生孢子用无菌水洗下，离心

（1 500 r/min，5 min）洗涤得到纯净孢子，加适量无菌水使其浓度达到在显微镜下每个视野中有30～50个孢子，另设空白对照，每组重复3次，26℃ 恒温培养箱培养12 h，观察孢子的萌发情况。每个玻片按5点取样法观察5个视野，计算孢子的萌发抑制率。

④菌丝超微结构的观察 a.菌丝形态扫描电镜的观察。将对照菌丝和处理18 h后培养6 d的菌丝刮下，离心（1 500 r/min，5 min，4℃）勾取菌丝并洗涤。用2.5%戊二醛溶液固定2.5 h；0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）冲洗4次，每次15 min；用30%、50%、70%、80%、90%、100%系列浓度梯乙醇各脱水10 min，醋酸异戊酯置换25 min，真空干燥后镀金[6]。制好的扫描电镜样品在扫描电镜下观察、拍照。

b.菌丝细胞透射电镜的观察。同上得到纯净的菌丝。在4℃ 下用3%的戊二醛固定2 h，0.1 mol/L PBS冲洗3次，每次10 min，浸泡于1%锇酸溶液中，4℃ 放置1 h，0.1 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min，50%、70%、90%系列浓度梯度的乙醇脱水15 min，再用100%的丙酮脱水3次，每次10 min，最后用环氧树脂作为包埋剂进行包埋，包埋后将样品放入恒温箱中进行聚合，制成超薄切片，分别用醋酸双氧铀和柠檬酸铅各染色30 min[7]。制备好的样品置于透射电镜下观察并记录。

⑤孢子超微结构的观察 将对照组孢子和处理18 h后培养6 d的孢子用无菌水洗下，离心

（1 500 r/min，5 min，4℃）弃上清液并洗涤得到纯净的孢子。采取相同方法制备透射电镜样品并观察。

⑥AO/EB（吖啶橙/溴乙锭）荧光标记检测细胞凋亡 将对照组孢子和处理18 h后培养6 d的孢子用无菌水洗下，离心（1 500 r/min，5 min，4℃）洗涤得到纯净孢子，加1.5 mL无菌水重新悬浮。取各处理孢子悬浮液50 μL，分别加入AO/EB染料

2 μL混匀，30 s后于荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞[8]。

1.3 数据分析及处理

所有试验重复3次，试验所得数据用Data Processing System（DPS 7.05）软件进行显著性分析，采用Origin 8.0软件进行数据处理和图表制作。endprint

2 结果与分析

2.1 空气放电对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

由图1可以看出，ozone、NAI、ozone+NAI 3种处理方式对菌丝的生长均有抑制作用，处理时间越长抑菌效果越好，两者呈正相关关系。其中ozone+NAI的抑制作用最明显，其次是ozone处理组，NAI处理抑制作用最弱，说明ozone+NAI处理组较ozone和NAI单独处理组有明显的增效作用。由图1可看出，24 h 前ozone+NAI的抑菌效果顯著强于ozone和NAI单独处理组（P<0.05），24 h后这种差异逐渐减小，30 h后各组间差异不显著。

2.2 空气放电对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响

由图2可以看出，ozone、NAI、ozone+NAI 3种处理方式对孢子萌发均有明显抑制作用，孢子萌发率与处理时间呈负相关，处理时间越长孢子萌发率越低，即处理时间越长对孢子细胞损伤越大，降低其萌发率。ozone+NAI处理对孢子细胞损伤最大，其次为ozone和NAI单独处理组。结合图2可知，ozone+NAI的抑菌效果最强，ozone单独作用的抑菌效果优于NAI单独作用（P<0.05）。

2.3 空气放电对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响

通过扫描电子显微镜观察发现（图3），对照组菌丝形态正常，菌丝较为饱满，菌丝体表面光滑，粗细均匀一致，无褶皱或凹陷出现；经ozone、NAI、ozone+NAI处理后的菌丝形态发生了明显的变化，菌丝体干瘪褶皱且表面粗糙，外层结构不完整，其中ozone+NAI处理组菌丝体变形严重，说明ozone+NAI处理组较ozone和NAI单独处理组抑菌效果更为明显。

2.4 空气放电对尖孢镰刀菌菌丝细胞的影响

通过透射电子显微镜观察发现（图4），对照组菌丝细胞呈圆形或者椭圆形，细胞较为正常饱满；经ozone、NAI、ozone+NAI处理后的菌丝细胞发生较为明显的变化，细胞形态极不规则，细胞壁内陷或者突起。ozone+NAI处理对菌丝细胞的损伤比ozone和NAI单独作用明显，ozone处理对菌丝细胞的伤害大于NAI处理，以上结果说明空气放电能够导致菌丝细胞形态发生明显变化。

2.5 空气放电对尖孢镰刀菌孢子细胞的影响

通过透射电子显微镜观察发现（图5），对照组孢子细胞形态正常，呈椭圆形，细胞壁厚薄均匀，细胞内容物如线粒体、细胞核等细胞器结构较为完整，均匀分布在细胞质中且细胞质较为紧致，细胞壁、细胞膜无破损，胞外无外渗物，经ozone、NAI、ozone+NAI处理后的孢子细胞形态不规则，细胞壁内陷或者突起，细胞壁厚薄不均匀，且经ozone+NAI处理后的孢子细胞壁更薄，细胞内出现大量液泡且液泡体积较大，细胞质失去紧致结构，说明空气放电破坏了细胞的细胞器及完整结构。

2.6 AO/EB荧光标记检测细胞凋亡

由图6可以看出，未经空气放电处理的孢子细胞核染色质大都呈现绿色荧光，说明孢子细胞结构完整，细胞界限清晰，因为吖啶橙（AO）能自由透过细胞膜与DNA结合。而溴乙锭（EB）只能穿透破损细胞膜与DNA结合呈现橘红色荧光，经空气放电处理后的孢子细胞橘红色荧光明显增多，说明孢子细胞膜受损，通透性发生变化，孢子可能失去了正常萌发的能力。

2.7 空气放电对孢子细胞凋亡的影响

根据正常孢子和凋亡孢子所标记的吖啶橙和溴乙锭激发后的颜色差异，利用image pro plus 6.0对AO/EB荧光图像进行分析得到不同处理组在

18 h处理下的孢子细胞凋亡情况（图7），可看出空气放电处理组孢子凋亡率显著高于未处理组（P<0.05），且ozone+NAI处理组孢子凋亡率显著高于ozone和NAI单独处理组（P<0.05），而ozone单独作用效果优于NAI单独处理组，说明空气放电能够引起细胞凋亡，有明显的抑菌作用。

3 结论

空气放电对菌丝生长和孢子萌发有显著的抑制作用（P<0.05），且抑制效果与处理时间呈正相关。3种处理中，ozone+NAI处理组抑菌作用最为明显，ozone单独处理组的抑菌效果要优于NAI单独处理组。通过对菌丝、孢子超微结构的观察发现，空气放电处理后的菌丝体皱缩变形，同时处理后的菌丝细胞和孢子细胞形态发生变化，细胞壁内陷或者突起，厚薄不均匀，其中孢子细胞内出现大量液泡且液泡体积较大，细胞质失去紧致结构。AO/EB染色试验表明空气放电对细胞凋亡具有显著促进作用（P<0.05）。

参考文献

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[6] Jakubiak M， Giska I， Asztemborska M， et al. Bioaccumulation and biosorption of inorganic nanoparticles： factors affecting the efficiency of nanoparticle mycoextraction by liquid-grown mycelia of Pleurotus eryngii and Trametes versicolor[J]. Mycological Progress， 2014， 13（3）： 525-532.

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Effect on Vitality and Ultrastructure of Fusarium oxysporum by Air Discharge

LIU Mengdie1， TANG Hui1， LI Jie2， YAN Shoulei1， WANG Qingzhang1

（ 1.College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070；

2.Aquatic Vegetable Preservation and Processing Technology Engineering Research Center of Hubei Province ）

Abstract： In this study， air discharge technology was adopted to investigate the effects on the vitality and ultrastructure of Fusarium oxysporum by bacteriostatic test in vitro. The results showed that air discharge had significant inhibition on mycelial growth and spore germination of F. oxysporum （P<0.05） and the inhibition ratio was positively correlated with treatment time. Structural damages were analyzed by scanning electron microscopy （SEM） and transmission electron

microscopy （TEM）. SEM observation indicated that， after air discharge treatments， the mycelium was dry and wrinkled with rough and incomplete surface. Cells of mycelia and spores were irregular in shape， and cell walls had invagination or protrusions with uneven thickness. In spore cells， a large number of vacuoles with a larger volume appeared and cytoplasm lost compact structure. The results by AO/EB fluorescent dye mark showed that air discharge significantly promoted the spore apoptosis （P<0.05）.

Key words： Air discharge； Fusarium oxysporum； Inhibition； Ultrastructureendprint