闽茄5号及其近缘新组合的SRAP鉴定

陈继兵+黄建都+林峰+林翮飞+林文

摘 要：利用SRAP分子标记技术，对闽茄5号及其亲本材料、新组合（06-29×06-16）及其亲本材料的DNA特异型条带进行分析研究，经过多次重复试验，从100对引物组合中筛选出1对引物（Em2/Me5）能扩增出闽茄5号及其父本的多态性条带；1对引物（Em3/Me3）能扩增出新组合（06-29×06-16）及其父本的多态性条带。说明该方法重复性好、准确性高的优点，可用于茄子近缘品种间的检测。

关键词：闽茄5号；茄子；SRAP；分子标记

中图分类号：S641.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）20-0050-03

茄子（Solanum melongena L.）为茄科茄属植物，是世界上热带和温带地区重要的蔬菜，含有多种维生素、脂肪、糖以及矿物质等，特别是富含维生素P，具有许多药用价值，是一种很好的保健蔬菜。闽茄5号是福州市蔬菜科学研究所选育的优良茄子新品种，其母本为中晚熟类型06-29，父本为中熟类型06-13。闽茄5号属中熟类型，较耐低温弱光，始花节位10～11节，果形直，果色紫红，果肉白，抗病性强 [1]。2015年通过福建省非主要农作物认定，已在生产上大面积推广。新组合（06-29×06-16）的母本与闽茄5号相同，父本为早熟类型06-16，在制种时容易发生混杂。种子纯度是种子质量的重要内容，也是农民增收的重要保证。因此，试验以闽茄5号及其亲本和新组合（06-29×06-16）及其亲本作为材料，通过SRAP分子标记技术，建立闽茄5号及新组合（06-29×06-16）DNA指纹图谱，在提高种子质量、纯度检测及生产推广方面提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

闽茄5号及其父本1、新组合（06-29×06-16）及其父本2和共同的母本均由福州市蔬菜科学研究所茄子课题组提供。采用穴盘育苗，待幼苗长到2～3片真叶时取嫩叶提取DNA备用。SRAP引物参照Li等[2]的报道进行设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。dNTPs、Taq DNA酶、Buffer等由博彩公司生产。

1.2 试验方法

①茄子DNA提取 随机选取各样本10株，剪取刚展开的新鲜茄子嫩叶20 g，放至液氮中研磨。采用改良的CTAB法提取茄子总DNA[3]，利用紫外分光光度計在260 nm和280 nm下测定OD值，检验DNA的质量和浓度，使用时将DNA稀释到40 ng/L。

②SRAP扩增 选择10条上游引物和10条下游引物，随机配成100对引物组合。25 μL反应体系为：30 ng/μL DNA 模板，2.0 mmol/L MgCl2，

200 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L 引物，0.75 U Taq酶。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸2 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

③PCR产物的检测 采用1%的琼脂糖凝胶，恒压120 V电泳35 min。使用EB染色，在凝胶成像系统上观察并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 多态性引物的筛选

利用10条上游引物（Me1～Me10）和10条下游引物（Em1～Em10）组成的100对引物组合对供试材料的混合DNA进行扩增筛选。结果表明，大部分SRAP引物均能在250～2 000 bp扩增出条带。选择条带清晰并且条带数目较多的引物组合对闽茄5号、新组合（06-29×06-16）及各自亲本材料进行SRAP扩增。筛选出1对引物组合（Me5/Em2）扩增的闽茄5号谱带表现为偏父型；1对引物组合（Me3/Em3）扩增的新组合（06-29×06-16）谱带表现为偏父型。

2.2 指纹图谱的建立

利用筛选出的具有特异性谱带的引物进行SRAP扩增，经过多次重复试验，结果表明，引物组合Me5/Em2 对闽茄5号扩增在1 200 bp具有偏父性条带（图1）；引物组合Me3/Em3对新组合（06-29×06-16）扩增在460 bp具有偏父性条带（图2）。2对引物组合的扩增产物具有高度稳定性和重复性。

3 小结与讨论

本试验利用SRAP分子标记技术对闽茄5号及新组合进行PCR扩增，经过多次重复试验，筛选出Me5/Em2和Me3/Em3分别对闽茄5号及新组合建立指纹图谱，可以将闽茄5号及新组合很好地区分开。

SRAP标记是显性标记，并且符合孟德尔遗传规律，亲本所具有的特异性带能在杂交F1代的谱带中表现出来[4]，因此，通过检测F1代带中是否出现双亲的特异性带，可以对不同品种进行鉴定。在新品种选育过程中，一些优势较强的自交系往往作为母本被重复利用，因而选育出的新组合与原品种之间具有较高的同源性，用分子标记检测种子纯度时不能选择母本的特异型条带，而应以父本的特异型带进行筛选。在制种前也可以利用此图谱作为父本除杂的依据，提高种子质量。

参考文献

[1] 陈继兵，林峰，林文.茄子新品种闽茄5号的选育[J].中国蔬菜，2012（24）：99-100.

[2] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103： 455-461.

[3] 王关林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002：742-744.

[4] 郭修武，张鹏翔，郭印山，等.应用SRAP分子标记技术鉴定葡萄种间杂交后代[J].分子植物育种，2011（9）：1 389-1 393.endprint