猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测方法的研究进展

时间：2024-05-31

文/山东绿都生物科技有限公司李天芝于新友

文/山东绿都生物科技有限公司李天芝于新友

本文综述了猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测方法，主要包括核酸探针、普通RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增等6种方法，对猪传染性胃肠炎病毒病的防控有一定的参考价值。

猪传染性胃肠炎病毒；分子生物学；检测方法

传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）引起的一种以呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征的高度传染性疾病［1］，秋始、冬春为该病高发期。该病最初发生在美国，随后世界各地均有相关报道，我国20世纪50年代首次报道TGE，1956年台湾省分离到TGEV。目前我国大部分地区都有该病发生流行，各种不同品种和周龄的猪都能感染TGEV并发病，2周龄受到的危害最为严重，一旦感染后，其死亡率可高达100%。5周龄以上的猪感染后虽然死亡率不高，但生长缓慢，饲料利用率低，给养猪业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类疾病中必检的传染病［2］。随着分子生物学的发展，出现了许多新的检测方法，目前已经广泛应用于各种病毒病和细菌病的检测，且有很好的发展前景。本文综述了TGEV的分子生物学检测方法，为TGE的诊断和防控提供参考。

1 核酸探针

核酸探针检测方法的原理是核苷酸碱基顺序互补，采用标记物标记一段可与被测定的靶序列互补单链核酸分子，从而检测目的核酸序列。Kim等［3］用地高辛标记TGEV核衣壳蛋白cDNA基因序列，制备探针，建立了检测TGEV的核酸探针方法，对25份临床样品进行检测，阳性率为81%，该法与病毒分离、荧光抗体试验、扫描电镜的方法相比，特异性较好，可实现对病毒的快速检测。史喜菊等［4］分别设计了猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪传染性胃肠炎（TGEV）和猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）等5种病毒的MLPA探针，将这5种探针混合，建立了可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。该方法特异性试验表明，针对每种病毒的探针都只能扩增出其对应的病毒模板，其余病毒模板的扩增都是阴性结果，而且5种探针混合物都只能从单个目的病毒中扩增出单一的特异性条带，而猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的扩增均为阴性。敏感性试验结果表明，五重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸3，000～6，000个拷贝。

2 普通RT-PCR方法

参照已知的病原相关目的基因的序列，用软件设计引物，采用相关的试剂和仪器体外大量扩增目的基因，是一种快速的分子生物检测方法。王黎等［5］成功建立了检测TGEV的RTPCR方法。以等量同一浓度的同一TGEV阳性病毒液进行重复性试验，其3次扩增特异性条带大小均为590bp。以猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（RV）进行特异性试验，其结果显示，仅TGEV扩增得到预期特异性目的条带。以TGEV阳性病毒液提取的cDNA用紫外分析仪确定核酸质量浓度为1g/L后，用ddH2O按10倍稀释，稀释度为10-1～10-5，其均能扩增出590bp特异性条带。张作华等［6］试验根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因序列设计了1对特异性引物，建立一种TGEV的RTPCR检测方法，结果表明：该方法具有高度的特异性和较好的重复性，可检测到1×10-3μg/μL的TGEV DNA，并可用于临床上TGEV感染引起的传染病病原学的检测。

3 套式RT-PCR方法

套式PCR方法是设计内、外2对引物，通过2次扩增对样品检测，该法能节省时间和试剂用量，且敏感性较高。沈海娥等［7］根据猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的S基因核苷酸序列，设计合成了2对引物，以猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒细胞培养物为模板，进行PCR特异性片段扩增，猪传染性胃肠炎病毒扩增片段大小为886bp，猪呼吸道冠状病毒扩增片段大小为214bp。王玉洁等［8］根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）基因序列，利用Primer5.0程序软件，设计并合成了M基因的2对引物，以mRNA为模板，通过RT-PCR、RT-nested PCR方法，成功扩增出长度为1，328bp和1，037bp 的TGEV目的片段，但未扩增出猪传染性腹泻病毒（PEDV）片段。在优化RTPCR反应条件的基础上，建立了快速检测TGEV的诊断方法。母文华等［9］根据GenBank中收录的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）纤突蛋白S基因的核酸序列设计了2对引物，以mRNA为模板，通过RT-PCR、RT-nestedPCR方法，在优化RT-PCR反应条件的基础上，建立了快速检测TGEV的RT-nested PCR诊断方法。试验结果成功扩增出长度为886bp和690bp的TGEV目的片段，但未扩增出猪传染性腹泻病毒（PEDV）片段。

4 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR检测方法是在普通PCR检测方法基础上发展起来的，可以实现在一个PCR反应体系中加入多对引物，通过优化PCR反应条件，能同时检测多种病原，可节约成本，节省时间，目前也广泛用于临床各种疾病的快速诊断。郭容利等［10］建立了一种同时检测PEDV、TGEV和猪A群轮状病毒（PARV）的三重RTPCR方法，并对其进行特异性与敏感性试验，该法能检测约50TCID50的混合病毒，能够扩增出3条长度为750bp（PEDV），544bp（TGEV），275bp（PARV）特异性片段，而其他病毒无特异性条带。吴洋等［11］建立了可同时检测PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增，结果显示，该方法可以同时扩增PEDV（682bp）、TGEV（480bp）和PRV（297bp）的特异性DNA片段，而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性，该法对PEDV、TGEV和PRV的检测得到最低拷贝数分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。郑世民等［12］根据GenBank中TGEV和PEDV 的S蛋白基因序列分别设计1套特异性引物，建立了TGEV和PEDV的RTPCR快速检测方法，该法对TGEV和PEDV扩增的目的片段的大小分别为426bp和583bp，经优化确立最佳反应体系：引物、MgCl2和dNTP浓度分别为8μmol/L、9μmol/L和14μmol/ L，退火温度为54℃。贾锐等［13］根据GenBank中已收录的TGEV、PEDV的序列，利用Primer5.0计合成了2对特异性引物，并用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化，然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件，结果同时扩增到2条与试验设计相符的492bp（PEDV）和211bp（TGEV）特异性条带，建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法，可检测出约11pg的PEDV和13pg的TGEV。徐引弟等［14］建立了可同时检测PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法，该法能同时检测PEDV、TGEV和RV，但对CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PPV等无扩增，检测的抗原稀释极限为107。

5 荧光定量RT-PCR方法

荧光定量PCR检测方法是在反应体系中加入SYBR GreenⅠ荧光染料或用荧光探针标记反应产物，然后根据反应仪器收集荧光信号的强弱来确定产物的量，从而实现对起始模板进行准确定量，与常规RT-PCR相比，不需要电泳检测就可以检测样品，更方便、直观，可减少产物对环境的污染。王慧珊等［15］建立了能鉴别检测猪传染性胃肠炎病毒和呼吸道冠状病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，该法能同时检测这两种病毒，通过与常规RT-PCR试验比较表明，所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感，检测限3h以内，具有很好的特异性和重复性。董玲娟等［16］建立了TGEV荧光定量RTPCR检测方法，该法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级，对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107～1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测，检出1份阳性，与普通PCR检测方法符合率为100%。王建中等［17］参照GenBank发表的TGEV S基因序列设计引物，通过优化反应条件，建立了检测TGEV的荧光定量PCR检测方法，结果显示，该法具有良好的特异性，对其它病原的检测结果为阴性，其检测敏感性可达43.07拷贝/μL，是普通RT-PCR检测方法的100倍。张雪等［18］建立一种基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR方法，结果显示，扩增效率为103%，相邻扩增曲线之间间距均匀，所有产物的熔解曲线都具有单一整齐的峰，标准曲线具有优良的线性关系，最低可准确检测63拷贝/μL的核酸模板，重复性试验的变异系数小于3%，然后用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性，对65份临床样品的检出率高于常规PCR。

6 环介导等温扩增技术

环介导恒温扩增检测方法（LAMP）是一种新兴的分子生物学检测方法，已广泛应用于多种细菌病和病毒病的检测，该法具有检测速度快、敏感性好、特异性高且操作比较简单等特点，适合基层兽医部门的应用。高睿泽等［19］建立针对TGEV N基因的RT-LAMP快速检测方法，并对该检测方法的特异性与灵敏性进行了评价。该方法在63℃恒温下作用50min，使TGEV N基因获得了高效率特异性扩增，与猪流行性腹泻病毒等其它猪易感病毒无交叉反应，具有很好的特异性，同时该方法具有极高的灵敏性，可检测到131.4fg/μL的目标病毒DNA，比普通PCR的灵敏度高3个数量级。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化，结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。

7 小结与展望

随着分子生物学的发展，各国专家、学者先后建立了多种TGEV分子生物学检测方法，但这些方法各有利弊，普通RT-PCR、套式RT-PCR和多重RT-PCR等方法虽然检测简单、快速、方便但不能精确定量，且敏感性有限，容易漏检。荧光定量RTPCR检测方法弥补了普通PCR方法的缺点，但所用器材和试剂成本高，且对操作人员有更高的要求，不利于其在基层兽医部门大规模推广应用。LAMP方法是一种新兴的方法，操作简便，不需要特殊仪器和设备，更适合基层应用。单独使用任何一种方法都很难正确诊断猪传染性胃肠炎病，将各种方法结合起来，综合判断，不同部门应该根据自己的试剂情况选择相应的方法，相信随着分子生物学技术的不断发展，在不久的将来会有更多新型分子生物学诊断方法建立，从而为猪传染性胃肠炎病毒病的诊断、分子流行病学调查和防控提供保障。

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