一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定

姚春阳，徐文豪，马先强

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州 256600；2.滨州市滨城区农业农村综合服务中心山东滨州 256600；3.惠民县农业农村服务中心山东滨州 251700）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea vrus，PEDV）可导致哺乳仔猪中引起严重的肠炎、水样腹泻、呕吐、脱水直到死亡，通常称为“冬季拉稀病”、“打水枪”，育肥猪、母猪对该病毒有抵抗力，能耐过。20 世纪70 年代，猪流行性腹泻（PED）作为一种急性肠道传染病首先在英国出现[1]，随后，该病在捷克共和国、匈牙利、韩国、意大利、泰国、中国、美国等许多国家暴发。我国是生猪养殖大国，自2010 年底以来PEDV 变异株在我国各地猪群中大规模暴发流行，大量仔猪患病死亡，特别是对3 日龄之内的仔猪病死率可达100%，给我国造成了巨大的经济损失[2]。

PEDV 病毒粒子核酸为线性单股正链RNA，作为一种α 冠状病毒，在粪便中病毒粒子是多形态的，趋于圆形，病毒颗粒表面有纤突，平均直径（包括纤突）在130nm 左右，PEDV 仅在病猪小肠黏膜上皮细胞中繁殖，只有一种血清型。PEDV 基因组全长28kb左右，纤突S 蛋白、核衣壳N 蛋白、囊膜E 蛋白及膜M 蛋白是其主要结构蛋白，其中S 蛋白由1383 个氨基酸组成，在PED 的流行中，S 蛋白的S1 区常常发生变异，根据这一特征性变异可区分经典毒株和变异毒株，并为疫苗的选择提供理论依据。本试验从山东省某猪场暴发仔猪腹泻疫病的发病猪群中采集粪便样品，在Vero 细胞中进行了病毒的分离、RT－PCR 鉴定及测序分析，证实所分离毒株为PEDV 变异株。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料采自山东省某猪场疑似暴发PEDV 猪群的仔猪腹泻粪便，-70℃保存备用。

1.2 细胞及主要试剂

Vero 细胞为本实验室保存；TRIGene 总RNA 提取试剂为GeneStar 产品，DL2000DNA Marker、pMD18-T 载体、一步法RT-PCR 相关试剂为宝日医生物技术（北京）有限公司产品，DNA凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒为爱思进生物技术（杭州）有限公司产品；新生牛血清为Biolological Industry 产品、DMEM 干粉培养基和胰酶为Gibco 公司产品、S 蛋白单克隆抗体购自韩国金诺公司；FITC 标记的山羊抗小鼠二抗购自Abcam 公司。

1.2 方法

1）粪便的RT-PCR 检测粪便样品经无菌生理盐水（体积比约1：5）重悬离心后取上清液，使用TRIGene 总RNA 提取试剂提取上清液中病毒核酸，使用PEDV 鉴定引物[3]（表1）对提取的核酸进行检测。反应体系：2X 一步法RT-PCR 试剂12.5μL，上、下游引物混合液2μL（PEDV-F 与PEDV-R 引物10μM）、提取总RNA 3μL，加入灭菌水补充至总体积为25uL。

反应程序：50℃ 10min，95℃预 变 性5min；95℃变 性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30 个循环，再进行72℃延伸5min，4℃终止反应。

2）病毒的分离 检测为阳性的离心上清液样品用0.45μm 无菌滤器过滤除菌后接种于Vero 细胞，于37℃的CO2（5%）培养箱中恒温恒湿培养，每天观察细胞病变（CPE）。连续体外传代3～5代。

3）分离毒株S1 基因扩增及序列分析利用S1 基因扩增引物[4]（表1）对分离毒株进行S1 基因的扩增（反应体系和程序同1.2.1），经胶回收后连接PMD18-T 载体，经鉴定后送往并测序分析。

表1 引物序列及长度

4）PEDV S1 基因序列核苷酸同源性分析利用DNAstar 软件对S1 基因测序结果进行基因信息比对分析，与GenBank 中已上传的国内外部分PEDV 参考毒株S1 基因序列进行同源性比对和遗传进化分析。

2 结果

2.1 粪便的RT-PCR 检测

4 份腹泻仔猪病料处理后，提取核酸，经RT-PCR 检测后2 份样本扩增出了492bp 左右大小的目的条带，如图1 所示

图1 PEDV RT-PCR 鉴定及分离毒S1 基因的扩增

2.2 病毒的分离

病料上清液样接种于Vero 细胞，于37℃的CO2（5%）培养箱中恒温恒湿培养，连续体外传代4 代后出现了典型的合胞体病变，呈现变圆、融合等现象（图2b），间接免疫荧光试验证实，该分离株可以与PEDV 特异性单抗发生反应（图2c）。收取病毒液后继续进行传代培养，最终获得1 株能够在Vero 细胞上稳定传代的PEDV毒株。

图2 PEDV 分离株分离鉴定

2.3 分离毒株S1 基因扩增及序列分析

提取分离病毒的病毒RNA，通过RT-PCR 成功扩增出分离株S1 基因片段，大小约2376bp，与预期相符，如图1 所示，PCR 产物经回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果表明该PEDV 分离株为一变异毒株，NCBI blast 分析表明该分离株与G2-b 亚群分离株同源性最高，在98.5%以上，表明分离毒株为PEDV G2-b 亚群。

3 讨论

PEDV 在细胞上分离培养一直是研究的热点问题，1988 年，Hofmann 等首次通过次通过在Vero 细胞培养液中添加一定浓度的胰酶成功分离出PEDV，随后众多国内外学者相继报道了成功在Vero 细胞上分离到PEDV，但分离病毒的成功率一直不高。由于PEDV 病毒属于RNA 病毒，变异较快，传统的弱毒疫苗和灭活疫苗到一定时期将不能对仔猪起到有效的保护作用。因此，快速分离和鉴定当前流行的PEDV 毒株平台的建立，可以辅助针对当前流行毒株的疫苗的开发，用于PEDV 流行株的预防和控制。近几年来，我国众多学者在PEDV 分离平台建设方面取得较快发展，已成功分离到众多猪流行性腹泻流行株，2017 年庞文静从陕西省某养猪场发病仔猪病料中分离到1 株PEDV 病毒，该分离毒用Vero 细胞盲传至8 代以后出现较为稳定的细胞病变，经RT-PCR 鉴定及测序分析，最终确定该分离毒株为PEDV，将其命名为PEDV HZ 株[5]。2018 年吴白等人从山东某暴发腹泻的猪场腹泻粪便中分离到一株PEDV 分离株，该分离株口服接种3 日龄仔猪后可以出现典型的PED 临床症状[3]。2019 年唐融志等人从山东莒县某猪场发病小猪肠道内容物及粪便中分离到一株PEDV[4]，2020 年王晓斐等人从河南焦作某猪场哺乳仔病料中分离到PEDV[6]，2021 年王娜等人从上海地区某猪场发病仔猪病料中分离到猪流行性腹泻流行毒株，该分离毒属于重组毒株G2-b 亚群，与近年来强毒株S 蛋白的氨基酸序列较为一致[7]。本研究用实验室Vero e6 细胞，基于建立的RT-PCR 检测技术建立起了PEDV 分离平台，成功分离到了一株PEDV 流行毒株，该毒株为变异毒株，毒株的成功分离为更好的了解和掌握PEDV 在山东的流行状况和对PED 疫苗的选择提供数据支持和物质基础。