动物疫病监测及注意事项

刘娜

（河北省饶阳县动物疫病预防控制中心河北衡水 053900）

动物疫病监测是一种主动、系统深入的资料记录形式，是指对某种或某些疫病（包括传染病和非传染病）长期、完整、连续定期的观察，收集，核对，分析疫病动态分布和影响因素资料，跟踪疫病的发生、分布和变化趋势，并将信息及时上报和反馈，以便进一步开展调查研究，对疫病进行预警预报，提出有效的防控对策和措施，从而达到防控疫病的目的。

疫情监测方案具体到日常上级下达的监测任务和跨省调运需要监测的临时监测，及每年春秋季防疫后的集中监测。动物疫病监测一直以来是动物疫病预防控制的主要内容之一，有效的动物防疫以及动物疫病监测，能够保证相关养殖人员及时地掌握动物生长实际，并及时掌握疫病和疫情的实际状况，结合实际和现有的防疫手段、监测手段等，去进行免疫工作，可依据检测记录去及时调整防疫措施、控制疫情。现就今年春季奶牛口蹄疫集中免疫抗体监测为例阐述如下。

1 采集样品具体信息

某翔和某凯两家奶牛养殖企业，采样奶牛日龄均为成年泌乳牛，采样数量均为60 份。某凯奶牛场免疫的是中农威特的口蹄疫疫苗，免疫时间为2021 年4 月15 日。某翔奶牛场免疫的是天康生物股份有限公司的口蹄疫疫苗，免疫时间为2021 年3 月1 日。临床表现均为采食正常，健康牛。试剂盒采用的是青岛立见诊断技术发展中心生产的口蹄疫病毒O 型竞争ELISA 抗体检测试剂盒和兰州兽研生物科技有限公司生产的改进型口蹄疫病毒O 型液相阻断ELISA 抗体检测试剂盒。

2 试验准备

试剂盒、样品放置室温25℃平衡30min 以上；恒温箱调至37℃；洗涤液按说明书倍数稀释；酶标仪调至450nm 状态；实验操作在血清学实验室生物安全柜进行；移液器按所需量程准备；严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.1 口蹄疫病毒O 型竞争ELISA 抗体检测

酶标仪读取数据阴性血清对照值为2.494 和2.509，阳性血清对照值为0.095 和0.086，阴性血清的平均OD 值为2.5015，大于0.5，且阳性血清抑制率为96.3%，大于50%，试验结果有效，试验成立。读取数值结果，某凯奶牛场的样品数值在0.052～0.203 之间，经判定全部样品为阳性。某翔奶牛场的样品数值在0.605～0.819 之间，经判定样品全部为阳性。

2.2 改进型口蹄疫病毒O 型液相阻断ELISA 抗体检测

采取的20 份样品的布局，加入病毒抗原后样品血清的稀释度第一孔为1：16，然后倍比向下稀释至1：128。阳性对照的稀释度为1：32，然后倍比向下稀释至1：4096。阴性对照血清设两个孔稀释度分别为1：4 和1：8。酶标仪读取数据阴性血清对照值为1.818 和1.879，病毒抗原对照值为2.101、2.078、2.117、2.085，阳性血清对照一列数值依次为0.102、0.136、0.235、0.495、0.925、1.434、1.702、1.974。依据试验成立条件：病毒抗原对照D450nm 值在1.0以上。阳性对照抗体效价在1：1024± 1 滴度以内。阴性对照血清抗体效价＜1：8，试验结果有效，试验成立。读取数值结果，某翔奶牛场的样品第一排稀释度1：16 数值在0.081～0.269 之间，第四排稀释度1：128 数值在0.104～0.301 之间。经判定全部样品为阳性。牛抗体效价均≥1：128，99%以上保护。某凯奶牛场的的样品第一排稀释度1：16 数值在0.077～0.131 之间，第四排稀释度1：128数值在0.167～0.360 之间，经判定样品全部为阳性。牛抗体效价均≥1：128，99%以上保护。

2.3 两种试剂盒的比较

口蹄疫病毒O 型竞争ELISA 抗体检测是定性检测，只能判断免疫的奶牛血清中抗体是否产生，不能判断免疫的奶牛抗体的保护率。操作快捷，用时较短，样品布板份数多。改进型口蹄疫病毒O型液相阻断ELISA 抗体检测是定量检测，能精准到保护率高低多少。但同时操作的份数较少，相对用时就会长些。

3 注意事项

1）血清的采集。采集过程中防止溶血，溶血会导致吸光度升高，影响检测结果。血液应在室温中凝固20～30min，然后2,000～3,000r/min 离心，取上清部分，血清量应足够检测所需。

2）移液器。使用的移液器要定期校准，确保试剂用量精准，检测数据的精准。

3）吸头：配合移液器量程使用。每个标准品与待测样品不能重复使用同一个吸头加样。加入不同样品和不同试剂成分时，应该更换移液器吸头，以避免出现交叉污染。

4）洗涤液、稀释液配置以及盛放洗涤液的容器应保持清洁，以防止微生物污染导致非特异性反应。按照说明书的比例配制洗涤液。如20 倍稀释，即1mL 浓缩洗涤液加入19mL 蒸馏水。稀释后的洗液可在室温下保存24h。如果出现结晶物，可放置于37℃恒温箱内5～10min。浓缩洗涤液出现浑浊或絮状物请勿使用。

5）加样：调整移液器刻度，设定容量值。移液器移取液体试剂和样品血清。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将吸头插入液面下2～3mm，用大拇指将移液器顶部按钮按至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点，接着将按钮按至第一停点排出液体稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体后松开按钮。使用多道（如8道或12 道）移液器，则可以将移液器的第一道对准第一个枪头，然后倾斜插入，前后方向摇动即可卡紧，避免用重力撞击，吸头卡紧后可看到连接部分形成清晰的密封圈。

6）处理大批量样本时，首孔与末孔加样时间间隔过长会导致各微孔间有不同的起始反应时间，从而影响到测量值的准确性和重复性。为保证不同样品的孵育时间一致，可先取待检样品、FDMV AC 阴性血清、FDMV AC 阳性血清不低于10μl 分别加入96孔板中并做好记录，然后用多道移液器移至FDMV AC 抗原包被板相应孔中。也可在抗原包被板直接加样。

7）微量振荡：对微孔内的混合溶液进行充分混匀。将已用封口贴封闭的微孔板平稳牢固的放置于微量振荡器的载物平台上，以中等档位的力度震荡30s。手工混匀：单手握微孔板架长边两侧，在实验操作台上向左右轻轻平行摇晃60s，使混合液体均匀。将已密封的微孔板放置于室温或恒温箱37℃中温育反应。

8）温育：在温育前将封口贴紧覆盖在微孔板上，确保无缝隙，将密封好的微孔板放置在37℃的恒温箱内，为了能够使试剂得到充分的反应，温育的温度非常重要。

9）洗涤：①手工清洗微孔板内的残余物质。将提前配置的洗涤液加入移液槽里，然后快速甩掉微孔板内反应液于废液池内，用300μL量程的多道移液器吸取280μL 洗涤液，在微量血凝板上方倾斜45 度以吸头出水口对准微孔逐一冲洗3～5 次（依据日常操作习惯微孔板近身端可微微平行向右偏移10°左右，更利于移液器吸头对准微孔板各孔进行洗板），将各孔注满洗液，静置1min，甩掉微孔板内洗液，按照以上步骤重复3 次。手工清洗应注意冲洗水流的力度适中，不宜过大。洗涤时各孔均需加满洗涤液（不能过满，防止溢出），防止孔口有游离的物质不能洗净。洗板结束后必须立即拍打干净，不可使酶标板自然干燥。②洗板机：自动清洗微孔板内的残余物质。将提前配置的洗液加入自动洗板机的洗液瓶里，然后快速甩掉微孔板内反应液于废液池内，使用洗板机洗板3 次，每次浸泡1min，清洗后拍干反应板。洗板机喷水口很容易被洗液形成的结晶物堵塞，造成各孔间较大差异，因此应当注意按时对洗板机进行清洁保养。

10）避光装置：底物溶液B 应避光保存，底物溶液使用时应该现用现配，如出现变色，应弃之不用。操作中应将加入显色剂的微孔板放置在无杂物的抽屉或盒子内，使外部可见光无法照射到即可。

11）拍板；在清洗微孔后，将微孔板倒置在吸水纸上（一般采用的方法是无菌纱布折叠数层），单手握紧吸水纸与微孔板的侧面边缘，微孔板面向下，用力拍打，将附着在微孔壁和微孔底上的残余液体吸附干净（不可以将吸水纸直接放入微孔中），同时还要清除板底残留的液体和手指印。彻底的清洗和拍干，可以提高吸光度数值读取的精准性。

12）酶标仪读数：读取微孔板内各孔液体的吸光度。滤光片应设置检测波长为450nm。测定结果以酶标仪读数为准，读取结果时，应擦干酶标板底部，且微孔内不能有气泡。不要触碰孔底部的外壁，轻微的指印和划痕都可能影响最终的读数。

13）通常意义上的室温是指18～25℃的环境。如果温差在±5℃时，应使用空调装置调节室内温度以达到试验要求。

14）不同批号的特异性试剂不可混用，通用试剂可以交互使用，不可以与其他厂商的试剂混用，超过有效期限的试剂不可使用。

15）所有样品、废液和废弃物都应按照传染物处理销毁。

综上所述，动物疫病监测工作需要操作细致入微，仪器精准可靠。既要保护操作者自身安全又确保监测的价值。监测是依靠正确的操作和规范，从技术的角度提取各种数据和指标，经过量化处理，预先对动物疫病的种类、危害情况、病情发展情况等均予以了解，并且还可有效控制动物疫病的发生与发展，避免出现动物疫病大规模暴发情况。为后续动物疫病防控，提供一定的参考价值和解决措施。但当前，在畜禽养殖业发展过程中，广大养殖户对动物疫病的监测不够重视，需要下乡入户进行宣传普及知识，让养殖户对动物疫病监测有一个正确的认识，积极采取适合自场的有效的监测方案，制定适合自场的防疫措施，从而降低疫病发病几率，提高疫病监测的治疗和效果，促进养殖业的可持续发展。