牦牛感染牛病毒性腹泻病毒的诊断

任宜家

（青海省海北州祁连县畜牧兽医站 青海海北 810499）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，为牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）的致病原。BVDV的感染非常普遍，可以感染黄牛、水牛、牦牛和猪、羊等动物，是当前危害养牛业的重要病毒性传染病之一。患病动物和带毒动物为主要传染源，病畜的分泌物和排泄物都含有病毒，病毒可通过接触以及空气水平传播，还可以通过胎盘垂直传播，致使新生犊牛发生流产或死胎。不同饲养方式、品种和年龄的牛均易感，但对犊牛的危害最为严重，一年四季都可发生，冬末和春季高发。牦牛是我国高原牧区特有的一个独立物种，牦牛全身是宝，其奶和肉可食用，毛皮可以制作皮革和衣服，粪便可以作为燃料，既可以用来农耕也可以作为高原地区的交通工具，是当前青海省农村饲养的主要家畜，而牛病是一直困扰着基层牦牛养殖户的棘手问题，特别是BVDV感染常有发生。2018年3月，青海省西宁市某牧区的牦牛养殖场发生一起以消瘦、食欲下降、发热、黏膜糜烂和腹泻为主要特征的疫病，通过临床症状初步怀疑为BVDV感染，通过实验室PCR检测最终确诊了疫情，为采取积极的治疗措施提供了参考依据。现将发生这起牦牛感染BVDV病例的整个诊断情况汇报如下。

1 临床诊断

1.1 发病情况

该牦牛场共饲养牦牛100余头，2018年3月，陆续有牦犊牛发生高热、咳嗽、腹泻和死亡，就诊时已死亡犊牛3头，发病后养殖场曾利用青霉素等抗生素进行药物治疗，但效果不明显。

1.2 临床症状

发病牦牛表现食欲下降，被毛凌乱，发热，体温达42.0℃，咳嗽，眼鼻有浆液性分泌物，口腔黏膜糜烂，流涎，精神不振，发生严重腹泻，粪便恶臭、含少量血丝或黏膜，消瘦、脱水最后死亡。

1.3 剖检病变

对病死牦牛剖检可见食道黏膜糜烂，瘤胃黏膜有出血和糜烂，肠内容物稀薄，肠壁薄，水肿，肠黏膜出血，肠系膜淋巴结肿大，小肠、空肠和回肠都有炎性病变。根据发病情况、临床症状和剖检观察结果初步怀疑为BVDV感染，无菌采集脾及肠系膜淋巴结送实验室检验。

2 实验室诊断

2.1 核酸提取

将病料样品按1:3比例加生理盐水，用研磨器研磨成组织匀浆，取上清液利用病毒基因组RNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物技术有限公司）提取核酸RNA。

2.2 一步法RT-PCR扩增

以提取的RNA为模板，利用牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒（购自北京百奥莱博科技有限公司）进行一步法RT-PCR扩增，一步法RT-PCR反应程序为：50℃反转录40min；94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸6min；4℃终止反应。

2.3 电泳检测

一步法RT-PCR扩增结束后，取扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外成像仪下观察检测结果，结果显示在约258bp具有特异性核酸片段，说明检测结果为BVDV阳性。

3 综合诊断结果

根据疾病的临床表现和实验室PCR检测结果，确诊该牦牛养殖场发生了BVDV感染。

4 讨论

近年来，随着我国对特种动物养殖的不断扶持，牦牛养殖产业得到了快速发展，但由于基层养殖单位疫病防控意识薄弱，致使牦牛疫病的流行率逐步增加，其中BVDV感染是危害当前牦犊牛的主要疫病，给牦牛养殖经济效益带来了严重损失，也制约着我国牦牛产业的进一步发展，加强牦牛BVDV的防控对保障牦牛养殖业健康发展至关重要。BVDV感染可引起牦牛的发热、咳嗽、腹泻以及怀孕母牛流产等临床表现，临床中一般可以根据这些特征进行初步诊断，但在实际养殖生产中，由于牛的体质和感染状态不同，一般发病症状并不明显，且临床中BVDV引起的临床表现与大肠杆菌、沙门氏菌引起的腹泻极其相似，凭借肉眼观察或者临床经验只能进行初诊，确诊必须借助实验室诊断。目前BVDV的实验室检测方法主要包括常规RT-PCR、一步法RT-PCR、荧光定量RT-PCR、病毒分离培养、病毒中和试验、ELISA方法等，其中以RT-PCR检测方法操作最简单、检测最快速，且RT-PCR方法可以检测到不同病原体特定的核苷酸序列，大大提高了BVDV的检出率和准确率。而一步法RT-PCR检测方法将反转录过程和PCR扩增过程简化至一步反应，解决了常规RT-PCR方法需要反转录和PCR扩增分开进行的缺陷，大大降低了检测成本、减少了检测操作、缩短了检测时间，鉴于此，本研究利用一步法RTPCR检测试剂盒对病例进行确诊，为养殖场采取积极的治疗措施赢得了时间。养殖场根据确诊结果通过紧急采取隔离饲养、环境消毒、疫苗免疫接种、补液、对症治疗以及应用磺胺类药物防止继发细菌感染等综合性防控措施，养牛场病牛逐渐康复，此次疫情得到了有效控制。

BVDV通过侵入牛的呼吸道及消化道黏膜上皮细胞进行复制，病毒入血后可以形成病毒血症，BVDV能通过胎盘屏障，妊娠母牛感染后会出现流产，或产下有先天性缺陷的犊牛，如小脑发育不全等。BVDV感染后会导致免疫抑制，本病可以在牛群中潜伏感染，当机体抵抗力下降时发病。BVDV的垂直感染以及免疫抑制增加了BVDV防控的难度，且临床中BVDV与各种细菌病混合感染的情况经常发生，一旦发生混合感染将大大提高BVDV的致死率。对于BVDV的防控一般应采取以预防为主的综合性防控措施，要求养殖场一定要搞好环境卫生，保持牛舍的空气清洁，保证良好的通风，牛粪便要及时清理，防止与其他病原菌混合感染，做好疫苗免疫接种和血清学监测，一旦发现阳性牛要及时淘汰，做好牛群的净化工作。发病牛要尽早隔离饲养，对症治疗，给予补液和止泻处理，同时给予抗生素和抗病毒营养物质，防止继发感染和脱水死亡。■