一株犬瘟热病毒部分基因片段的特性分析

邵伟庚　潘婧　黄利亚　王晓龙

摘要：犬瘟热是一种急性、烈性、高度接触性的病毒性传染病，致死率很高，严重威胁多种珍贵野生动物的健康，并对毛皮动物养殖产业造成巨大的经济损失，探讨其基因组的遗传变异情况极为重要。本研究使用4对特异性引物，采用RT-PCR方法并结合系统发育分析，对犬瘟热L基因进行特异性分析。结果表明，CDV-L基因与41株犬瘟热病毒病的核苷酸和氨基酸同源性分别在92.33%～98.95%和80.93%～98.28%，同时扩增得到的毒株序列与登录号为KM926612（1992年中国艾鼬）、EU726268（2008年中国水貂）、HM063009（1989年哈萨克斯坦水貂）以及HM046486（2007年哈萨克斯坦海豹）处于同一分支上，这对于该基因型毒株的溯源研究具有一定的意义。

关键词：犬瘟热病毒；RT-PCR检测；L基因；序列分析

犬瘟热（canine distemper，CD）是一种由犬瘟热病毒（can‘inedistemper virus，CDV）引起的多宿主的烈性、急性、高度接触性的病毒性传染病。CDV可引发多种动物患病，致死率极高。CD分布全球，很多国家和地区均有报道家养或野生动物感染CD的案例，同时在过去的几十年中，其感染宿主范围在不断扩大。我国很多地区大型毛皮动物养殖场、动物园甚至保护区内均有动物感染CD而死亡的报道。同时国宝大熊猫、旗舰物种东北虎等多种珍贵野生动物对CDV也高度易感。CD已经成为威胁多种野生种群数量和生存健康的极重要的传染病。这一系列事件使得对CD研究的重要性日益突出。

1实验材料

實验样本为本室保存的患犬瘟热的貉子膀胱上皮组织。为避免样本反复冻融，剪下部分组织分装于RNase-free 1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

2实验方法

2.1貉犬瘟热RT-PCR方法检测

合成4对扩增CDV-L基因的特异性引物（表1），按照Invitrogen公司的总RNA提取试剂盒的操作说明提取病毒基因组总RNA。反转录得到cDNA。反转录采用20μL体系：5#LRNA模板、3μL RNase free H₂O、1μL dNTPMixture（10mM each）、1μL上游引物（2pmol/μL）。

2.2貉犬瘟热病毒序列分析

根据优化的反应体系和条件所得，PCR扩增体系为20止：Mix10止，ddH₂O 7μL，上游引物0.5μL（20pmol/μL），下游引物0.5μL（20pmol/μL），cDNA 2μL。反应条件预变性95℃5min；变性95℃30s，退火53℃30s，延伸72℃2min，35个循环；再延伸72℃10min。

1%琼脂糖粉凝胶电泳检测，切胶回收并送测序公司测序。

使用SeqMan和BioEdit软件将4条序列拼接，并保存为fast格式，选择ClustalW对其进行多重序列比对，计算貉源犬瘟热与其他宿主CDV的同源百分比。

将比对结果导入MEGA 6.0软件，采用P-distance方法和N-J模型构建进化树，设置Bootstrap值为1000。

3结果分析

3.1RT-PCR检测结果

扩增的CDV-L基因的4条片段长度分别为990bp、900bp、850bD和1025bp，同预测扩增片段相同，如图1所示。

3.2CDV-L基因序列结果分析

CDV-L基因与41种有代表性的犬瘟热病毒病L基因核苷酸同源性在92，33%-98.95%，氨基酸同源性在80.93%-98.28%，与登录号为KM926612（1992年发现于中国艾鼬的基因序列）的毒株同源性最高，为98.95%，与登录号为KM280689（2012年发现于乌拉圭狼的基因序列）的毒株同源性最低，为92.39%。

所构建的系统发育树如图2所示，可知扩增得到的毒株与登录号为KM926612（1992年中国艾鼬）、EU726268（2008年中国水貂）、HM063009（1989年哈萨克斯坦水貂）以及HM046486（2007年哈萨克斯坦海豹）处于同一分支上。

4讨论

动物感染CDV后致死率极高，甚至可达100%，同时CDV全球均有分布，可感染多种动物，无特定宿主屏障，研究中貉犬瘟热病毒与艾鼬、水貂、海豹等宿主体内检测的CDV的核酸及氨基酸的同源性较高，并处于系统发育树的同一分支。

本次检测的4段基因只是CDV全基因组中L基因的部分片段，并不能完全反映整个病毒毒株的特异性，因此在后续的研究中将会继续扩增其它片段，拼接完成后再进行分析，这样可以更好反映该患病貉CDV的特异性及变异程度。