两种奶牛结核病检测方法的比较研究

孙建文　达剑森

摘要：牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病，严重威胁着人类的健康。因此，对该病的定期检疫对公共卫生和食品安全具有重大意义。本研究采用提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应试验和y-干扰素（IFN-y）ELISA试验，对扬州市的892头奶牛进行结核病检测。结果表明，PPD皮内变态反应检出的31头牛型结核阳性牛和可疑牛中，经IFN-yELISA试验检测仅检出9头禽型结核可疑牛。PPD皮内变态反应试验特异性较差，出现了较高的假阳性率，其原因可能与禽结核分枝杆菌感染或其他非特异性因素的干扰有关。

关键词：结核病；结核菌素；y-干扰素；酶联免疫吸附测定

牛结核病（Bovinetuberculo-sis，BTB），是由牛结核分枝杆菌（M.bovis）引起的一种人和多种家畜共患的慢性传染病，以组织器官的结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。在家畜中，以奶牛最为易感，其次为水牛、黄牛和牦牛。农业部将其列为二类动物疫病，卫生部将其列为乙类人间传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病。PPD皮内变态反应试验是OIE规定的金标准，在普查牛结核病中广泛使用，但其特异性较低，日常检测中假阳性率较高。近年来，IFN-yELISA试验以其高特异性和灵敏度的优势，受到广大业内人士的关注。本研究旨在通过比较PPD皮内变态反应法和IFN-yELISA方法在检测奶牛结核病时的优缺点，为确定快速准确的奶牛结核病诊断方法提供参考，同时也为今后开展扬州市奶牛结核病的流行病学调查提供技术支撑。

1.材料与方法

1.1试验动物

奶牛抗凝血样品来自2013-2015年度扬州市某区两个奶牛场，检测对象为两场全部青壮年牛和成年奶牛，3年合计检测数为892头（3年分别为272头、296头和324头）。

1.2试剂

牛型提纯结核菌素（为黑龙江省生物制品一厂产品）；游标卡尺（0～150mm）（为上海量具刀具厂产品）。生化培养箱（HWS-250，为上海森信实验仪器有限公司产品）；生物安全柜（BSC-1500ⅡA2-X，为济南鑫贝生物技术有限公司产品），酶标仪（RT-6000，为深圳雷杜生命科学股份有限公司产品），IFN-y检测试剂盒（BovigamTM）（为PrionicsAG公司产品），刺激原禽型提纯结核菌素（PPD-A）和牛型提纯结核菌素（PPD-B）（均为瑞士Prionics公司产品）。

1.3方法

1.3.1PPD皮内变态反应

根据动物结核病诊断技术（GB/T18645-2002），用牛结核菌素0.1mL注射于牛的颈中部（左侧或右侧），分别于72h和120h进行两次观察，观察局部有无热肿胀痛的炎性反应，并量取皮皱厚度得出皮厚差。结果判定：以皮厚差大于4mm为阳性，2～4mm为可疑，小于2mm为阴性。凡检测为可疑的牛于检测后60d进行复检，复检后仍为可疑的牛判为阳性。

1.3.2IFN-yELISA试验

PPD皮内变态反应检测结果为阳性或可疑的牛，在30d后采抗凝血5mL，无菌条件下将抗凝血加入24孔细胞培养板（每份样品作3孔重复，1.5mL/孔）；对应孔中分别加入100uL无菌PBS（作阴性对照）、刺激原禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素，抗原与分装的血液充分混匀后振荡1min，以上操作在采血后6h内进行；将加样完毕后的细胞培养板在37℃培养箱中孵育过夜（24h）；收集上清（不少于300uL）-20℃贮存待检。

使用IFN-y检测试剂盒对样品进行检测，方法参照试剂盒说明书操作。

2.结果与分析

2.1PPD皮内变态反应检测结果

3年间用PPD皮内变态反应共检测两个奶牛场样本892头，结核阳性和疑似的奶牛为31头（次），检测结果见表1，阴性牛数据未列出。

由表1可知：2013年两个奶牛场第1次检测有9头牛判定为结核阳性，其中A场有4头，B场有5头；有4头牛判定为可疑，其中A场有3头，B场有1头。然后对这4头牛进行了严格的隔离，相隔60d后进行了复检。复检由同一人操作，采用同样材料和方法，结果表明：这4头牛复检皮厚差均小于2mm，判定为阴性。

2014年两个奶牛场第1次检测有3头牛判定为结核阳性，其中A场有1头，B场有2头；有13头牛判定为可疑，其中A场有7头，B场有6头。隔离60d后复检，结果表明：13头可疑牛中，有5条牛判定为可疑；有8头牛判定为阴性。

2015年两个奶牛场第1次检测有1头牛判定为结核阳性，属A场；有1头牛判定为可疑，属B场，隔离60d后复检，结果为阴性。

通过连续3年的监测，发现A场PPD皮内变态反应检测结果阳性数分别为4、4、1头，其阳性率分别为2.56%、2.38%、0.55%；B场逐年监测的阳性数分别为5、4、0头，阳性率分别为4.31%、3.13%、0。两个奶牛场3年来阳性率分别为3.31%、2.70%、0.31%，结果呈现逐年下降趋势。

2.2IFN-YELISA检测结果

对初检PPD检测结果为阳性或可疑的31头奶牛的抗凝血经IFN-YELISA试验检测，结果均为阴性。但其中有9头牛禽型结核分枝杆菌检测结果为可疑。

2.3两次皮内变态反应与IFN-Y诱导试验检测结果的比较

表2数据说明，两个奶牛场3年来PPD皮内变态反应检测结果假阳性率较高，笔者推测结果可能受到禽型结核分枝杆菌感染或其他非特异性因素干扰。

3.讨论

PPD皮内变态反应是国际贸易的诊断准，也是在全球范围内用于牛结核病检疫和净化应用最为广泛的方法。该方法的优点在于试剂成本较低，适于在基层广泛使用；但同时又因其过程耗时较长、影响因素较多、60d内复检阳性率降低等缺点，其检测结果易受某些病原感染、治疗药物、人为误差、个体差异等较多因素影响，结果常出现一定比例的假阳性、假阴性，无法保证其敏感性、特异性和准确性。尤其是对于可疑病例，检测工作量更大，耗时更长，在基层奶牛结核病净化工作中的弊端日益显现，若单独用该方法，对检出的阳性牛即实行“检疫-扑杀”策略，会误杀一些假阳性牛，一定程度上会造成较大的经济损失。

本试验对892头奶牛使用PPD皮内变态反应和IFN-yELISA方法进行了对比检测，从结果可以看出，PPD方法非特异性较强，出现较多的假阳性/假阴性结果。2013-2015年来对扬州市某区的2个奶牛场通过PPD皮内变态反应进行初检，用IFN-yELISA试验对阳性牛和可疑牛进行复检，PPD皮内变态反应结果（13/892）与IFN-yELISA试验结果（0/31）的吻合度较差，与文献报道结果一致。从本试验数据可看出，有9头牛的检测结果可能与其受到禽型结核分枝杆菌感染有关。另外，在复检前对牛群进行了驱虫，结果阳性数下降，其原因可能与受寄生虫感染等非特异性因素干扰有关。

IFN-yyELISA方法操作简单快捷、敏感性好、特异性强，减少了人为误差，处于感染早期的牛也可检出，并且可以有效区分牛、禽型结核分枝杆菌以及假阳性牛，在奶牛结核病的检测和净化工作中可发挥重要作用。但是，目前将该方法进行大规模推广还存在一些困难，主要是因为进口试剂盒价格昂贵，检疫成本较高，样品前处理较为繁琐。本试验证明临床牛结核病的诊断可采取两种方法相结合的方式，利用IFN-yELISA方法对PPD皮内变态反应阳性牛和可疑的奶牛进行确诊检测，可以有效的排除禽结核的干扰，提高检测准确性，避免出现误杀。

综上所述，与PPD皮内变态反应相比，IFN-yELISA检测方法特异性较好，在实际检测过程中能够节省大量的时间，因此，在进行牛结核病检测时，可先采用PPD皮内变态反应进行筛查，检出阳性即采取隔离；然后采用y-干扰素ELISA检测方法进行综合判断，二者检测均为阳性的牛应立即予以淘汰，这样经过数轮检测淘汰，既可避免误杀、错杀，又可尽快达到净化牛结核病的目的。（编辑：赵晓松）