超低温冷冻保藏法在菌种保藏中的研究

夏隆春，郭慧君，刘秋红，王甜，李玉清

（山东胜利生物工程有限公司山东济宁272073）

超低温冷冻保藏法在菌种保藏中的研究

夏隆春，郭慧君*，刘秋红，王甜，李玉清

（山东胜利生物工程有限公司山东济宁272073）

菌种在工业发酵生产中对生产水平具有决定性的作用，在生产中一个合适的菌种保藏方法也很重要。超低温冷冻保藏法通过AIDCS测控系统把超低温冰箱的测温装置连接到电脑上，进行实时在线监测冰箱内温度，进行在线温度记录。通过菌种验证对比得出超低温冷冻保藏法具有保存时间长、保存费用低、不容易发生变异、利于操作的特点。得出这种方法在菌种保藏中值得推广。

超低温冰箱；菌种保藏；效价

菌种是一种极其重要和珍贵的的生物资源，它在工业生产水平中占有决定性的作用，但是他的世代时间一般很短，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此常造成工业菌种的退化，并有可能造成优良菌种的丢失，所以必须做好菌种的保存，长期保持菌种的活性[1]。超低温冷冻保藏法就是把需要保存的菌种加入合适的保护剂混匀后分装到冻存管中，放入超低温冰箱保藏。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株莫能菌素、恩拉霉素、海南霉素均是正常使用的菌种。

1.1.2 仪器超低温保存冰箱用-86℃超低温冰箱、AIDCS测控系统、电脑、液氮罐。

1.2 方法

1.2.1 超低温冰箱的在线监测系统运用AIDCS监控软件把温度感应装置通过温度调节器连接到电脑能够记录超低温冰箱在连续的时间点不同的位置其温度情况，AIDCS具有高性能的记录功能的特点，有超高温、停电报警、远程监控功能等。1.2.2超低温保存箱的均一稳定性验证超低温保存箱（以下简称冰箱）共有4层，每层均有独立的门可供开关，每层各均匀分布3个温度探头，共12个检测点检测温度，以此验证一下冰箱在连续的时间点不同的位置的温度情况。

1.2.3 超低温保存箱保藏菌种保存时间的验证将生产用菌种莫能菌素，恩拉霉素、海南霉素这3个品种的菌种的成熟斜面孢子在无菌状态刮下各自均分到含有冷冻保护剂的冻存管中制成冻存孢子，混匀后放入设定温度为-86℃的超低温冰箱中保存两年，中间隔4个月各取出1支冻存孢子进行效价验证。检验其效价是否降低。

1.2.4 超低温保藏方法与液氮超低温保藏方法的对比把恩拉霉素菌种制成冻存孢子，分别用超低温冷冻保藏法和液氮超低温保藏法这2种保藏法进行菌种保存[2]，从保存菌种效价的高低、便于操作和使用、保藏费用等各方面进行比较。

2 结果与分析

2.1 超低温冰箱的均一稳定性验证

验证方法为：等冰箱温度运行稳定到冰箱预设的温度-86℃后，冰箱内放入3品种的各一个菌种20支冻存孢子运行10 d，任意调出AIDCS监控软件连续运行48 h内数据报表，间隔时间为1 min，得出数据，因数据太多只挑取每层各1个检测点，间隔时间为8 h进行数据统计。层数从上层数为第一层，其记录数据见下表1。

表1 冰箱每层内不同的时间点温度情况

通过分析数据得出每个检测点温度波动范围在±1℃之间，温度波动不大，在正常范围内，说明冰箱的均一稳定性较好。但是第四层的温度比冰箱的设定温度略高5℃左右，分析原因应该是最下层与冰箱的压缩机等运行设备离得最近，造成实测温度比冰箱设定温度高。平常存放菌种时不把菌种放在最下层，以保证菌种存放的环境均一稳定。

2.2 超低温保存箱保藏菌种不同的保存时间效价情况

用超低温保存箱保藏菌种保存2年，每间隔4个月取一支冻存孢子验证其效价，莫能菌素、恩拉霉素、海南霉素这3个品种验证效价结果见表2。

表2 莫能菌素、恩拉霉素、海南霉素不同的保存时间效价情况

从表2结果可知，随着保藏时间的延长效价略有降低，在去除各方面允许的误差情况下，在长达两年的保藏时间里这3个品种的效价降低在5%以内，保藏1年效价降低在2%以内，随着保藏时间的延长效价略有降低。这3个品种的菌种均属于放线菌，说明此方法适合放线菌一些品种的短期保藏，保藏1年之内，不影响菌种的效价，在工业生产中一般生产菌种保存周期在1年以内，所以此方法适用于一些放线菌生产菌种的保藏。

2.3 两种保藏方法比较分析

超低温冷冻保藏法和液氮超低温保藏法这两种保藏方法进行比较，这两种方法均是通过把孢子或菌丝体与冷冻保护剂混匀后进行保藏，只是保藏的环境不同。

2.3.1 效价比较用恩拉霉素的冻存孢子分别进行两种方法的保藏，过一定时间后进行效价的验证，在保存时间上对这两种方法进行比较，其结果见表3。

表3 不同的保藏方法在相同的保存时间内其效价情况

从表3中可以看出用超低温冷冻保藏法保藏2年后效价降低2.2%，而液氮超低温保藏法2年后效价降低1.4%，因为每个时间点验证的是同一个菌种相同的菌种号，两种保藏方法相差0.8%，通过数据分析可知还是液氮超低温保藏法保藏年限比较长，不容易发生生产能力退化。而超低温冷冻保藏法略有退化，超低温冷冻保藏法比较适合于保藏周期中短期的菌种，生产菌种保藏周期较短适合于超低温冷冻保藏法。

2.3.2 费用比较两种保藏方法从保藏费用上进行比较，超低温冷冻保藏法用的是1 000 W的超低温保存箱保藏，每月的耗电量在800度电左右，而且冰箱的空间较大，可同时保藏1 000支冻存菌丝或冻存孢子，电费按0.5元/度，每支管1个月保藏费用为约0.4元。

液氮超低温保藏法，需要使用专用的液氮罐，1个50 L的液氮罐保藏菌种量为200支左右，每月正常需要补充30 L左右的液氮，液氮按10元/L，每支1个月管的保藏费用约为1.5元。

2.3.3 安全系数两种方法从安全系数上进行比较，液氮的保藏温度为-196℃，对冻存管的质量要求较高，必须严格采用耐低温的材质，而且冻存管放入液氮罐后前后温差变化较大，管口容易变松掉帽造成染菌。或使液氮进入管内导致拿取时管内液氮温度变高，液氮气化发生炸管，对工作人员造成伤害。而超低温冷冻保藏法相对于液氮保藏法，瞬间温差不是很大，不会造成管口变松、炸管。

以上两种方法保藏方式比较接近，但这两种保藏法各有侧重点，超低温冷冻保藏法因其需要保藏的周期在1年以内，比较适合于产抗生素的放线菌的生产菌种的保藏。而在主菌种库菌种保藏中，因是主菌种库的菌株少、保藏时间长，不经常取用，且在菌种退化方面要求更为严格，则更适合液氮超低温保藏法[3]。

3 讨论

通过对超低温冰箱的分析可知，超低温冷冻保藏法通过连接AIDCS测控系统连接电脑，通过报表查询，记录密度、可记录时间及查找方便方面均大大高于各种有纸或无纸纪录仪，在减轻了工作量的前提下使记录数据真实、准确和完整。通过两种保藏方法的对比得出超低温冷冻保藏法在保藏菌种1年内不容易退化，运行成本低、易于操作、安全系数高等优点。因此，在工业菌种保藏中，超低温冷冻保藏法是一种比较值得推广的保藏方法。■（编辑：李雨慈）

[1] 陶兴武,刘志国,田俊.生物工程概论[M].北京:化工工业出版社, 2010:162-165.

[2] 王冯艳,刘宝华,崔云,等.关于截短侧耳素菌种保藏的试验总结[J].生物技术世界,2014(09):72-73.

[3] 韩芹芹,李国庆,聂凡,等.液氮保藏平菇菌种的处理方法初探[J].食用菌学报,2010,增刊:57-60.

Study on Preservation of Strain in the Ultra-Low Temperature Freezing Preservation

Xia Longchun,Guo Huijun,Liu Qiuhong,Wang Tian,Li Yuqing
(Shandong Shengli Biological Engineering Co.,Ltd,Jining Shandong,272073)

The strain has a decisive effect on the level of production in the industrial fermentation production,in the production of an appropriate preservation methods is also very important.Ultra low temperature freezing preservation method of the temperature measuring device of super low temperature refrigerator is connected to the computer through AIDCS measurement and control system,real-time online monitoring of temperature inside the refrigerator,on-line temperature record.By contrast to ultra low temperature freezing strain verification preservation method has the characteristics of long preservation time,save costs low,not prone to mutation,easy operation.It demonstrated that the method is worth popularizing in the preservation of.

ultra low temperature freezer;strain preservation;titer

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.03.036

夏隆春，男（1981-），山东济宁人，本科学士，主要从事微生物发酵工程的研究。

*通讯作者：郭慧君，女（1981-），山东济宁，工程师，E-mail: xialc1981@163.com。