分子生物学技术在肠道菌群检测中的应用研究概述

刘凡铭 郭美薇 邹 伟

(辽宁师范大学生命科学学院 大连 116021)

人体肠道中栖息着数量巨大的微生物，它们的种类组成和活动影响着宿主的免疫、黏膜的发育和营养及药物的代谢[1]。肠道菌群研究中如何准确有效地选择菌群的检测方法十分关键。目前肠道菌群的检测方法大致分为两大类，即传统培养法和分子生物学方法。前者具有一定的局限性，如对于许多表型特征难以区别的菌种传统分类鉴定方法就无法准确加以鉴定；后者借助分子生物学技术，可以对肠道菌群进行精准的、分子水平的检测和分析。目前常用的分子生物学检测技术包括16S rDNA基因序列分析法、肠杆菌基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction， ERIC-PCR)技术、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization)、基因芯片技术(gene chip)及高通量测序技术(high-throughput sequencing)等，本文概述这些技术的研究进展。

1 16 S rRNA基因序列分析法

16 S rRNA基因是沉降系数为16的RNA片段，存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA基因序列分析法利用克隆和酶切等方法从细菌样本中获得16S rRNA，并将其与基因文库中细菌的16S rRNA基因序列进行比对分析，从而鉴定菌群的种类。

1.1 聚合酶链式反应 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。其原理是利用DNA在体外95℃高温时变性为单链，在60℃左右时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖的方向合成互补链，最终得到产物。而16S rRNA的PCR技术则是扩增粪便内的细菌rDNA，得到多个长度一致的16S rDNA片段，然后对这些片段进行分析测序[2]。但是由于此法利用了随机引物，在PCR的扩增过程中容易发生交叉而造成假阳性，影响结果的准确性。

1.2 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis， DGGE)是一个检测DNA突变的电泳系统，由Fisher等发明。该技术利用特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生的变化，将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis， TGGE)是继DGGE之后发展起来的一个DNA指纹图谱技术，与DGGE不同的是其电泳凝胶采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度，而是温度梯度。该方法利用不同构象的核酸分子具有不同的变性温度(Tm)进行分析，但与DGGE一样，相同DNA片段之间的单碱基对取代可以导致熔融行为的改变，且只能在一个位点内的一个小的DNA区域内检测到序列变异。此外，DGGE与TGGE都使用毒性凝胶，因此该技术应用范围相对较小。

1.3 荧光定量PCR技术 荧光定量PCR技术(realtime fluorescence quantitative PCR， RTFQ-PCR) RTFQ-PCR技术也称实时PCR(Real-Time PCR)或定量PCR(Q-PCR)，是一种核酸定量技术，是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点[3， 4]。但是由引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。因此，其单独使用而得到的结果是不充分、不全面的，需要结合其他技术加以辅助。

1.4 单链构象多态性技术 单链构象多态性技术(single-strand conformation polymorphism， SSCP)是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。在制定最佳的SSCP方法时应该考虑PCR片段的长度和凝胶运行的温度，且凝胶浓度不合适时会出现很多杂带，会给基因型的判定造成一定的困难。

2 ERIC-PCR分子杂交技术

随着人们对基因序列认识的深入，Sharples等[5]于1990年发现了“基因间重复单位”，此序列重复单位主要存在于大肠杆菌中，因此被称为肠杆菌基因间重复序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus， ERIC)，利用此序列设计引物就派生出了ERIC-PCR技术。ERIC-PCR是在随机引物PCR(RAPD)的基础上发展起来的对细菌DNA进行指纹图谱分析的一种方法。该技术存在很多问题，如引物太短、退火温度过低、不易获得稳定的图谱等。

3 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术是一种不依赖PCR的分子杂交技术，根据碱基互补配对原则，通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置[6]。荧光原位杂交技术可以用于肠道菌群的检测，但由于存在样品自身会产生荧光、rRNA含量低、探针特异性不足等因素导致的荧光信号消退等现象，且该方法只能针对已知的目标基因序列进行引物设计，因此在使用时通常需要结合其他分子生物学技术进行分析。

4 基因芯片技术

基因芯片又称为DNA微阵列，是一种在分子杂交技术基础上发展起来的新型技术。基因芯片技术主要是采用光导原位合成或微量点样等方法，将DNA探针形成DNA微阵列，然后与样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中的靶分子的数量[7]。该方法是一种能够同时检测多种细菌的分析方法，具有高通量、自动化、快速检测等特点。但仍然存在许多难以解决的问题，如成本高昂、复杂、检测灵敏度低、重复性差、分析范围狭窄等问题[7， 8]。

5 高通量测序技术

高通量测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。目前比较常见的测序平台就是Illumina Miseq高通量测序平台。Chen等[9]利用Illumina高通量测序技术比较研究了肠易激综合征(IBS)患者与健康供体的微生物群落差异，在IBS患者的肠道菌群中发现15个属呈现显著差异，并且6个属在IBS组和正常组的小鼠粪便标本之间显示出显著不同的丰度。Hai-Bing等[10]利用该技术对冠心病患者和健康人16S rDNA的V3-V5区进行测序，结果表明冠心病患者肠道致病菌数量高于健康人，并且R值也偏高。高通量测序技术日益成熟，其中Illumina高通量测序技术是一种新型的测序技术，也是目前较多应用于肠道微生物研究的前沿技术。

6 结语

近年来，分子生物学技术现已广泛应用于实验之中，解决了形态学检查、分离培养等传统方法繁琐、复杂的问题。PCR技术多用于肠道菌群研究中，并发展出rRNA/DNA-PCR序列分析、ERIC-PCR、 PCR-DGGE等分子技术，这些技术都可以揭示肠道微生态群落结构的动态变化。尤其是基于16S rRNA的分子生物学技术为肠道菌群的研究带来了第二春。但分子生物学技术自身也有很多的缺陷，因此应结合不同的检测技术进行肠道菌群的测定。