厚唇鱼CO1基因与CYTB基因克隆与结构特征分析

廖莉莉 谢永广 陈敦学

线粒体作为一种磷脂双分子层的细胞结构，存在于几乎所有的真核生物中。同时线粒体作为真核生物主要的供能器官，不仅可以通过氧化磷酸化作用为真核生物提供超过95%的能量[1]，同时由于线粒体DNA的高进化速率和特殊的结构特征，线粒体DNA也被作为一种分析物种进化的有效工具[2]。

线粒体DNA在脊椎动物中，具有较为保守的结构，其基因组共包含13个编码蛋白基因，2个rRNA基因，一个非编码的控制区，此外还包含22个tRNA间隔分布在13个编码蛋白基因之间。其分子量大约在16kb左右，由于缺乏自我修复系统以及母系遗传特征，线粒体DNA被广泛应用于系统进化分析及物种鉴定。CO1和CYTB基因往往被作为分析物种进化的有效工具而被广泛使用。Chen（2010）利用线粒体16S rRNA基因，CO1基因，以及CYTB基因分析了鳜类遗传分析[3]；柳淑芳（2010）利用CO1基因构建了石首鱼科的条形码，并进行了其系统分类研究[4]；彭居俐（2009）利用CO1基因进行了鲤科鲌属鱼类物种鉴定[5]；胡静（2014）利用CO1和CYTB基因分析了南中国海不同海域波纹唇鱼群体遗传多样性[6]；陈抒云（2015）利用CO1和CYTB基因进行了虫草属物种的寄主鉴定[7]。

自然状态下，光唇鱼广泛分布在河流和小溪的砾石沉积物中。由于厚唇鱼必须生长在优良水质中，因此厚唇鱼又被认为是水环境的检测者[8，9]。同时由于厚唇鱼具有漂亮的体色，又被作为观赏鱼养殖，深受广大消费者喜爱。目前有超过10种厚唇鱼属被鉴定与报道过[10]，厚唇鱼（A. labiatus）作为厚唇鱼属的重要物种，却很少被注意与研究，因此本研究拟以厚唇鱼CO1和CYTB基因为依托，分析厚唇鱼的进化特征。

1、材料与方法

1.1实验材料、试剂及仪器

实验所需厚唇鱼来至贵州省凯里市，用无水乙醇浸泡保存备用，实验所用生物试剂均为国产或者进口仪器，测序委托上海博尚生物有限公司完成。

1.2 基因组DNA的提取与鉴定

厚唇鱼基因组的提取采用天根生物公司的基因组组提取试剂盒进行提取，同时采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定吸光度确定浓度。

1.3 引物设计，PCR与数据分析

实验采用同源克隆技术进行克隆，以厚唇鱼属的A. fasciatus和A. Parallens序列为参考，设计CO1与CYTB基因克隆引物，构建克隆载体并进行双向测序分析，并对测序结果进行拼接与评价。

2、结果与分析

2.1 CO1与CYTB基因结构特征分析

将测序得到的序列进行拼接，去除重复序列，并在NCBI数据库进行比对，发现厚唇鱼CO1与CYTB基因分别长度为1551bp与1141bp，分别编码516与380个氨基酸。其起始密码子分别为GTG与ATG，终止密码子分别为GAA和T--，其中CYTB出现了不完全终止密码子。分析发现CO1与CYTB基因本身没有特殊的A+T偏好性，然而，在第三位碱基上，其G碱基含量却明显偏低，分别为7.0和5.8，远低于一般情况，此外，整个CO1基因与CYTB基因的G碱基含量都偏低（17.3和14.6）。这种情况在脊椎动物线粒体中是比较常见的现象。

在分析相近物种进化过程中，由于GC-skew在属内或者相近物种中，具有较大变化，因此分析物种的GC-skew对分析物种的进化也具有重要作用[11]，因此本文分析了11種厚唇鱼属CO1和CYTB的GC-skew，结果显示厚唇鱼属的GC-skew均呈现负值，且CYTB的GC-skew值明显小于CO1，而分析其AT-skew时却出现CO1为负值，CYTB为正值的情况，这与在全基因组上的结果不完全一致，脊椎动物全基因组一般都是CC-skew属于负值，而AT-skew主要偏向正值，具体原因可能是由于线粒体各个编码蛋白基因的进化速率不一样造成的。

2.2基因CO1与CYTB的进化分析

为了研究厚唇鱼属的物种进化关系，我们利用MEGA4.0软件，采用N-J分别构建的基因CO1和CYTB的进化树，分析其进化关系，其中Spinibarbus sinensis和Onychostoma rara作为外群，结果显示厚唇鱼属并没有完全聚成一簇，其中CO1中，选用的外群全部并入了厚唇鱼属，而在CYTB中，外群Spinibarbus sinensis作为独立的一支分化出来，而Onychostoma rara却依旧和厚唇鱼属并在一起，以上结果显示厚唇鱼属可能非单系起源。我们研究的厚唇鱼的亲缘关系确是确定的，首先是A. parallens 和A. Hemispinus聚成一支，然后在和我们的A.labiatus 进行聚合，这说明我们研究的厚唇鱼为一个独立的物种。

进化关系的准确性，与序列长短正相关，为了进一步阐明厚唇鱼属的物种进化关系，我们将所克隆得到的CO1基因与CYTB基因进行拼接后利用MEGA4.0软件构建NJ进化树分析，结果见图三，结果与CYTB构建进化树基本一样，然而，对研究中的厚唇鱼还是有少量差别，主要体现在小分支之间的差别。

3、讨论

3.1线粒体基因进化的适用性分析

在系统进化分析中，由于不同的基因片段进化速率不一样，选择合适的区段进行分析一直是研究进化分析的难点，早期的研究中，受限于数据库中数据量的限制，只能进行利用长片段进行高级阶元的分析，例如Zardoya就选用了8种脊椎动物的线粒体基因组的高级阶元的分析[12]。随着数据库数据量的增大，选择一个或者几个具有代表性的片段简单快捷的分析物种的进化关系就显得尤为重要了。早期研究中Zardoya认为CO1和CYTB具有很好的适用性，然而Miya却认为CO1与CYTB不具有最好的适用性[13]。在本研究中，我们采用目前通用的CO1和CYTB进行进化分析。

3.2線粒体碱基组成与使用规则分析

线粒体基因具有较好的保守性，比较分析其碱基组成发现CO1基因与CYTB基因中，其G碱基含量都非常低，这与所报道的硬骨鱼类线粒体基因组G碱基含量低是一致的。同时分析整个厚唇鱼属的AT-skew和GC-skew，发现其数值变化趋势也基本一样，且数值差别不大，这似乎可以证明厚唇鱼属分化时间还不长，彼此之前差别也不大，与进化分析结果一致的。

参考文献：

[1]Shen YY， Shi P， Sun BY， et al. Relaxation of selectiveconstraints on avian mitochondrial DNA following thedegeneration of flight ability. Genome Res 2009； 19： 1760-1765.

[2]Chen D， Li Y， Li H， Wang K， Du S， Chu W， Zhang J. The genetic diversity ofsinipercid fishes based on complete mitochondrial DNA of six sinipercid fishesfrom different drainages in China. Curr Mol Med. 2014；14（10）：1279-85.

[3]Catanese G， Manchado M， Infante C. 2010. Evolutionaryrelatedness of mackerels of the genus Scomber based on complete mitochondrial genomes： Strong support to the recognition of Atlantic Scomber colias and Paci?c Scomber japonicus as distinct species. Gene 452（1）：35–43.

[4]柳淑芳，陈亮亮，戴芳群，庄志猛. 基于线粒体CO1基因的DNA条形码在石首鱼科（Sciaenidae）鱼类系统分类中的应用[J]. 海洋与湖沼，2010，41（02）：223-232.

[5]彭居俐，王绪祯，王丁，何舜平. 基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用[J]. 水生生物学报，2009，33（02）：271-276.

[6]胡静，侯新远，尹绍武，祝斐，贾一何，王小军. 基于mtDNA COⅠ和Cytb基因序列对南中国海不同海域波纹唇鱼群体遗传多样性的研究[J]. 水生生物学报，2014，38（06）： 1008-1016.

[7]陈抒云，曹树萍，袁航，过立农，林羽，陈丹，郑健，林瑞超. 线粒体COI和CYTB基因在虫草属物种寄主昆虫鉴定中的适用性分析[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2015， 17（01）：182-188.

[8]Liu GD， Sheng Z， Wang YF， Han YL， Zhou Y， Zhu JQ（2016） Glutathione peroxidase 1expression， malondialdehyde levels and histological alterations in the liver ofAcrossocheilus fasciatus exposed to cadmium chloride. Gene. 578（2）：210-218.

[9]ZhangYM， Yan JQ （2010） Observations on embryonic development of Acrossocheilusfasciatus. J Shaoxing Univ. 30， 44-48 （In Chinese）.

[10]Xie XY， Huang GF， Li YT， Zhang YT， Chen SX（2015） Complete mitochondrial genome ofAcrossocheilus parallens （Cypriniformes， Barbinae）. Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal. 27（5）：3339-3340.

[11]Nesnidal MP， Helmkampf M， Bruchhaus I， Hausdorf B（2011） The complete mitochondrial genome of Flustra foliacea （Ectoprocta， Cheilostomata）-compositional biasaffects phylogenetic analyses of lophotrochozoan relationships. BMC Genomics.23；12：572.

[12]Zardoya R， Meyer A. The completeDNA sequence of the mitochondrial genome of a "livingfossil，" the coelacanth （Latimeriachalumnae）[J]. Genetics. 1997 Jul；146（3）：995-1010.

[13]Miya M， Takeshima H， Endo H， Ishiguro NB， Inoue JG. Major patterns of higher teleostean phylogenies： a new perspective based on 100 complete mitochondrial DNA sequences[J].Mol Phylogenet Evol. 2003 Jan；26（1）： 121-38.