三大基因编辑技术简介及其在畜牧育种中的研究进展

时伟程

【摘 要】随着社会的进步和人们对美好社会需求的不断提高，基因编辑技术迅速发展，被广泛应用于生命科学领域。本文对基因编辑的三大技术方法进行简要介绍，同时对其在畜牧育种中的研究进行综述，并对未来基因编辑技术进行展望，以期为进一步研究基因编辑技术提供理论依据。

【关键词】基因编辑技术；畜牧育种

基因编辑（Gene Editing）技术是指一种对目的基因或转录产物进行插入、敲除和定点突变等定点精确修饰的生物技术。该技术主要利用人工核酸酶实现对基因组上特定DNA片段的敲除、敲入或修饰。目前主要有三大基因编辑技术，锌指核酸酶（ZFNs）技术，类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术和CRISPR/Cas9技术。近年来，这三大技术在畜牧育种中应用广泛，在动物性状改良方面起到了巨大作用。

一、锌指核酸酶（ZFNs）技术

锌指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）是第一代人工核酸内切酶，由锌指蛋白（zinc finger proteins， ZFPs）的DNA识别结构与非特异性 FokI 核酸内切酶融合而成。ZFPs组成的 DNA 识别域包含至少三个Cys2His2锌指蛋白可与目的基因位点结合，而FokI 是一种核酸内切酶发挥“剪刀”的功能，对目的基因进行剪切，由此达到基因编辑的。ZFPs 作为一类特殊的转录调控因子，在生物体的细胞分化、胚胎发育以及基因表达调控等多个方面发挥重要作用。

在动物活体细胞中，Bibikova等首次利用ZFN技术在非洲爪蟾卵母细胞中实现了基因打靶，从此， ZFNs技术开始被广泛应用于多种哺乳动物的基因编辑中。2011年，Hauschild 等将 ZFNs基因组编辑技术应用于猪，利用基因打靶获得了α-1，3-半乳糖基因敲除猪，为器官移植技术提供了新的思路。Whyte等将体细胞核移植技术与ZFNs技术相结合，从而获得转基因猪。2013年，Marron等利用ZFN技术成功在猪上敲除了MSTN基因，使得猪肌肉生长抑制素的形成被破坏，从而使得猪的瘦肉率得到显著提高。Cui等在2015年利用ZFNs技术在猪上得到新的突破，获得了具有生长激素受体的转基因猪， 使得研究人类疾病有了理想的新动物模型。ZFNs技术研究在牛上研究同样广泛，2011年Yu 等利用ZFNs 技术，获得了具有更高牛奶营养品质的转基因牛，他们敲除了β-乳球蛋白基因，该基因在牛奶中具有致敏性。

ZFNs技术由于发现时间较早，研究广泛，试验技术虽相对完善，但脱靶现象严重，细胞毒性大等缺点使其进一步推广应用受到严重制约。

二、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术

转录激活因子效应物（transcription activator-like effector， TALE）和 FokI 连接构成了TALEN 结构。在ZFNs技术之后，TALEN是第二个被广泛认可的基因编辑技术。TALEN技术在应用时，首先要设计TALE的识别单元，TALE的DNA识别域由多个重复氨基酸模块组成，这些氨基酸序列十分保守。紧接着将识别单元与FokI相结合，构建TALEN质粒。TALEN技术的剪切机制是依靠TALE 特异性结合到靶位点上，其切割域形成特异性的二聚体，可使识别位点间的目标基因核苷酸实现断裂，从而完成目的基因编辑。目前构建TALEN 的方法主要有：TALEs“黄金大门”克隆法；迭代帽组装法；固相高通量自动连接技术；非连接酶依赖型克隆法等。

TALEN基因编辑技术被广泛应用于多种饲养动物中，2012年Carlson 等利用TALEN 技术敲除了猪细胞中多个基因，为 TALEN 技术在转基因猪上的广泛应用提供了研究思路。2013年， Xin等又利用该技术将猪的GGTA1基因成功进行定点敲除。2014年，Li等在猪上发现了ROSA26 基因位点，并成功利用 TALEN 技术进行定点敲入。2015年，Wu等利用 TALE技术成功在牛的常染色体中敲入小鼠的 SP110 基因，从而得到了23 头可抵抗牛结核分枝杆菌的转基因牛。同年在转基因羊的研究上，Cui 等利用TALEN技术将人乳铁蛋白敲入羊的常染色体使其替代了羊自身的β乳球蛋白，从而使得羊奶的营养价值得到了显著提高。

TALEN技术相较于ZFNs技术，其优势在于可以定点识别目标基因，从而使得基因剪切编辑更加准确高效，同时与ZFNs技术相比它的脱靶效应以及细胞毒性都得到了有效改善。

三、CRISPR/Cas9技术

CRISPR/Cas9技术是一种由RNA介导的基因编辑技术，该项技术的兴起引发了基因编辑领域新的革命。CRISPR是从对真菌和古菌宿主的研究中衍生而来的，1987年日本的Ishino等，在大肠杆菌的DNA中发现有串联间隔重复序列的特殊结构交替出现。一直到2012年，这种重复序列才被命名为规律性聚簇间隔短回文重复即CRISPR。CRISPR系统可分为三大类型： I型、II型和III型，CRISPR/Cas9便属于II型，II型系统相较于其他类型，结构较简单， 只需要一个Cas9蛋白来识别目的基因序列。现在最简便且应用最广泛的CRISPR/Cas9 技术是将利用sgRNA引导Cas9 蛋白识别特定基因序列的PAM区，造成双链 DNA 断裂，并启动 DNA 损伤修复机制。

目前CRISPR/Cas9技术在畜牧生产中被广泛应用。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技术编辑猪的vWF基因，从而为治疗血管性血友病提供了新的研究模型。2015年，水牛 BMP15 和 GDF9 基因被CRISPR/Cas9 技术进行编辑，从而加快了水牛繁殖性能的提高。2016年， Han等使用CRISPR/Cas9技术敲除了猪的Hoxc13基因， 从而为人类治疗外胚层发育不良提供了模型。2016年，在我国新疆，利用CRISPR/Cas9技术成功培育出具有不同毛色的转基因绵羊。2017年，Gao 等首次将NRAMP1基因利用CRISPR/Cas9技术敲入奶牛的基因组中，成功获得了转基因奶牛共11头，经研究发现，11头奶牛均未发生脱靶效应，说明CRISPR/Cas9技术可使基因编辑脱靶效应降低，从而为进一步研究轉基因家畜提供理论基础。此外，CRISPR/Cas9技术在小鼠细胞、恒河猴、食蟹猴、小鼠和人上均有相关研究报道。

CRISPR/Cas9技術与TALEN技术和ZFNs技术相比， 其切割效率相对较高且操作简单。同时，能够更为精确且高效的对目标基因进行定点编辑，并且同时进行多位点的编辑。CRISPR/Cas9 技术目前还具有一定的局限性，其受到 PAM 元件的制约，不能完全识别特异性的DNA序列。

四、展望

基因编辑技术被认为是一种理想的基因操作手段，至今已达到一定的高度，具有效率高、定向编辑准确性高、适应性广等优点。随着科学的快速发展，基因编辑技术必将不断完善，通过敲除和敲入等手段获得家畜优良的生产性状，加快我国畜牧业发展的速度，从而为改善国民生活做出贡献，此外也可利用基因编辑技术，建立动物研究模型，使其在生命科学和医学方面更好的为人类服务。此外，基因编辑技术还存在脱靶率高、特异性以及效率低等问题，更加有效的利用基因编辑技术还有待进一步研究。随着科学的发展，各种各样的基因编辑工具不断更新，使得人们对基因编辑的研究也更加深入，不过想要真正将其应用于畜牧育种中，还需科技工作者继续努力。

【参考文献】

[1] Carlson D.F， Tan W.F， Lillico S.G， Stverakova D， Proudfoot C， Christian M， Voytas D.F， Long C.R， Whitelaw C.B.A， and Fahrenkrug S.C. 2012， Efficient TALEN mediated gene knockout in livestock， Proc.Natl. Acad. Sci. USA， 109（43）.

[2] Cui C.C， Song Y.J， Liu J， Ge H， Li Q， Huang H， Hu L， Zhu H， Jin Y， and Zhang Y. 2015， Gene targeting by TALEN-induced homologous recombination in goats directs production of β-lactoglobulin-free， high-human lactoferrin milk， Sci. Rep.， 5： 10482.

[3] Cui D， Li F， Li Q， Li J， Zhao Y， Hu X， et al. Generation of a miniature pig disease model for human Laron syndrome. Sci Rep 2015； 5： 15603.

[4] Gao Y.P， Wu H.B， Wang Y.S， Liu X， Chen L.L， Li Q， Cui C.C， Liu X， Zhang J.C， and Zhang Y. 2017， Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP 1 knockin cattle with reduced off-target effects， Genome Biology， 18（1）： 13.

[5] Hai T， Teng F， Guo R.F， Li W， and Zhou Q. 2014， One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system， Cell Research， 24（3）： 372-375.

[6] Hauschild J， Petersen B， Santiago Y， Queisser A.L， Carnwath J.W， Lucas-Hahn A， Zhang L， Meng X.D， Gregory P.D， Schwinzer R， Cost G.J， Niemann H. 2011， Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases， Proc. Natl. Acad. Sci.， 108（29）： 12013-12017.

[7] Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， Amemura M， Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product. J Bacteriol 1987； 169（12）：5429-5433.

[8] Li X， Yang Y， Bu L， Guo X， Tang C， Song J， Fan N， Zhao B， Ouyang Z， Liu Z， Zhao Y， Yi X， Quan L， Liu S， Yang Z， Ouyang H， Chen Y.E， Wang Z， and Lai L. 2014， Rosa26-targeted swine models for stable gene over-expression and cre-mediated lineage tracing， Cell Research， 24（4）： 501-504.

[9] Whyte JJ， Zhao J， Wells KD， Samuel MS， Whitworth KM， Walters EM， et al. Gene targeting with zinc fi nger nucleases to produce cloned eGFP knockout pigs. Mol Reprod Dev 2011；78（1）： 2.

[10] Wu H.B， Wang Y.S， Zhang Y， Yang M.Q， Lü J.X， Liu J， and Zhang Y. 2015， TALE nickase-mediated SP110 knockin endows cattle with increased resistance to tuberculosis， Current Issue， 112（13）： E1530-E1539.

[11] Xin J， Yang H， Fan N， Zhao B， Ouyang Z， Liu Z， et al. Highly efficient generation of GGTA1 biallelic knockout inbred minipigs with TALENs. PLoS One 2013； 8（12）： e84250.

[12] Yu S.L， Luo J， SongZ.Y， Ding F， Dai Y， and Li N. 2011， Highly efficient modification of beta-lactoglobulin （BLG） gene via zinc-finger nucleases in cattle， Cell Res.， 21（11）： 1638-1640.