毛细管电泳多重RT-PCR法在儿童呼吸道感染中的应用分析

李云 沈国松 杨帆 闵晶 李刚

急性呼吸道感染是儿科常见的感染性疾病之一，在婴幼儿及学龄期儿童中，呼吸道病毒感染率远比成人多，年龄越小发生感染的比例越高[1]。病毒的流行特点、临床症状相似且感染力强、传播快，严重威胁小儿的生命健康。因此了解本地区病原体的流行病学特征，对儿童呼吸道感染的诊疗具有重要的临床意义[2]。本次研究分析毛细管电泳多重反转录聚合酶链（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法在儿童呼吸道感染中的应用效果。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2021 年12 月至2022 年3 月湖州市妇幼保健院呼吸道感染住院患儿的标本共478 例，其中男性283 例、女性195 例；年龄13 d～16 岁，平均年龄（1.68±1.62）岁；呼吸道感染诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》第7 版[3]。本次研究经医院伦理委员会审查通过，所有采样和资料收集均获得患儿监护人同意。

1.2 方法 采用睿司倍®13 种呼吸道病原体核酸检测试剂盒（由宁波海尔施基因科技公司生产）检测13 种呼吸道病毒，分别是甲型流感病毒（influen⁃za A virus，InfA）、甲型流感病毒H1N1（influenza A H1N1 virus，H1N1）、季节性H3N2 病毒（influenza A H3N2 virus，H3N2）、乙型流感病毒（influenza B vi⁃rus，InfB）、腺病毒（human adenovirus，HADV）、博卡病毒（human bocavirus，HBoV）、鼻病毒（human rhi⁃novirus，HRV）、副流感病毒（human parainfluenza vi⁃rus，HPIV）、冠状病毒（human coronavirus，HCoV）、呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）、偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，Mp）和衣原体（chlamydia，Ch）。

1.2.1 标本采集 入选患儿住院后立即采集标本，采用绒毛拭子从患儿咽后壁涂抹咽部分泌物标本，立即置于专用保存管中，-70 ℃低温冰箱保存至检测。

1.2.2 病毒核酸提取 采用全自动核酸提取仪Smart LabAssist-16（由台湾圆点奈米技术股份有限公司生产），按照核酸提取或纯化试剂盒（由宁波海尔施基因科技有限公司生产）说明书提取标本、阴阳性对照中的核酸。

1.2.3 多重RT-PCR 扩增 使用13 种呼吸道病原体多重检测试剂盒（由宁波海尔施基因科技有限公司生产），采用PCR 毛细电泳片段分析法。多重PCR产物置4 ℃保存至电泳检测。

1.2.4 电泳检测扩增产物 采用1T400 Sanger 测序仪（由宁波海尔施基因科技有限公司生产）对结果进行判读。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.00 统计软件进行数据分析。计数资料用例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 呼吸道病原体的检出情况 478 例患儿中共检出呼吸道病原体感染者342 例，检测阳性率为71.55%（342/478）。共检出病毒381 份，病毒检出率为79.71%（381/478）。13 种呼吸道病原体的检出率见表1。

表1 13 种呼吸道病原体检出结果

由表1 可见，HRSV 的检出率最高，达26.78%（128/478），其次为HRV 和HPIV，检出率分别为18.20%（87/478）和10.67%（51/478）。H1N1 和H3N2未检出。

2.2 呼吸道病所原体混合感染的检出情况 478 例呼吸道病原体感染阳性标本中，1 种病原体单一感染305 例，占89.18%（305/342），感染率63.81%（305/478）；2 种及以上病原体混合感染37 例，占10.82%（37/342），感染率7.74%（37/478）。混合感染具体感染类型及检出率见表2。

由表2 可见，在混合感染中，以2 种病原体合并感染为主，占94.59%（35/37），HRV 合并感染最多，占75.68%（28/37），其中以HRV+HRSV 混合感染多见。有2 例是3 种病原体混合感染，分别是HRV+HRSV+HPIV和HRV+HPIV+HCoV 混合感染。2.3 呼吸道病原体在不同性别中的检出情况 478 例呼吸道感染患儿中男性283 例、女性195 例。男性患儿中呼吸道病原体检测阳性率为68.90%（195/283），女性患儿为75.38%（147/195），二者差异无统计学意义（χ2=2.38，P＞0.05）。在男、女性患儿中，检出率最高的前3 种病原体均为HRSV、HRV 和HPIV。

表2 混合感染类型检出情况

2.4 呼吸道病原体在不同年龄组中的检出情况见表3

由表3 可见，5 个年龄组组间的13 种呼吸道病原体检出率比较，差异均有统计学意义（χ2=113.55，P＜0.05）。其中InfB、HADV、HRV、HRSV 和Ch 在不同年龄组患儿中的检出率比较，差异均有统计学意义（χ2分别=16.78、12.24、14.21、65.80、15.24，P均＜0.05）。

表3 13 种呼吸道病原体在不同年龄组中的检出率/例（%）

2.5 呼吸道病原体在不同月份中的检出情况见表4

由表4 可见，各月份组间的检出率比较，差异有统计学意义（χ2=20.32，P＜0.05）。其中HMPV、HCoV和HRSV在各月份组间的检出率比较，差异均有统计学意义（χ2分别=38.64、10.82、11.21，P均＜0.05）。

表4 13 种呼吸道病原体在不同月份的检出率/例（%）

3 讨论

急性呼吸道感染大多是由病毒引起的，病毒在不同地区、不同人群的病原学和流行病学表现均存在一定的差异，甚至在相同地区的不同年份也存在一定的差异。因此了解本地区的流行病学特征，对儿童呼吸道感染的诊断与治疗具有重要的临床意义。

本次研究采用基于毛细管电泳的多重RT-PCR方法对13 种呼吸道病原体进行检测，在本次研究中呼吸道病原体的总检出率为71.55%，稍高于刘文渊等[4]报道的宁波市儿童呼吸道感染病原体的检出率（66.16%），明显高于姚娟等[5]报道的2011～2013 年住院儿童呼吸道感染病原体的检出率（21.96%）。病原体的总检出率不同，考虑可能与检测方法、检测病原种类以及地区、季节差异有关。本次研究和刘文渊等[4]采用的都是高灵敏度的分子检测方法，检出率结果更接近，差异可能是由于研究的地区和季节不同引起的，而姚娟等[5]采用的则是直接免疫荧光法检测病毒抗原，该方法的缺点是敏感性低，且检测结果易受采样的质量和操作过程影响，结果的判断也与实验室检测人员的技术水平有关。而基于毛细管电泳的多重RT-PCR 法灵敏度高、特异性强，且病原体检测范围广，因此方法学的不一样导致同一地区病原体检出率差异明显。

本次研究还发现，年龄段不同的儿童病毒检出率存在差异。纳入研究的住院病例中，1 岁以下患儿占绝大多数，因为年龄越大，免疫力也随之提高，感染呼吸道病毒的几率在下降，感染的严重程度也在减轻，因此呼吸道感染的住院病例就越少。1 岁以下婴幼儿免疫系统还未成熟，3～6 个月婴幼儿体内尚存有来自母体的抗体，因而感染率相对较低，但随着与外界环境接触增加，来自母体的抗体逐渐消失而自身免疫系统发育尚不完全时，发生呼吸道感染的几率就会相应增加。1～3 岁幼儿群体间交叉感染机会增多，容易感染各类呼吸道病毒。其中RSV 是1 岁以内，尤其是3 个月以下新生儿检出的主要感染病毒，在本次研究中0～3 个月婴儿中RSV检出率53.78%，这与安徽地区感染特点一致[6]。

本次研究统计结果显示，呼吸道病原体在12月、1～3 月份间的检出率虽然有所不同，但主要检出的病原体均为HRSV 和HRV。这与刘文渊等[4]报道的Mp检出率最高，其次为HRV和HADV有所不同，考虑可能与各自分析的季节不同有关，本次研究分析的是冬春季节，而刘文渊等[4]研究的是7～10 月份夏秋季节，由此也可推出不同病原体流行与地区及气候有关。

综上所述，儿童呼吸道病毒感染在不同地区、不同年龄、不同月份均有一定差异。毛细管电泳的多重RT-RCR 方法可高效快速准确地检测多种病原体，及早明确病原体，也能防止临床上抗生素的滥用。同时本次研究也存在一些不足，由于基于毛细管电泳的多重RT-PCR 方法在本地区尚处于初步发展阶段，开展时间短，纳入病例少，数据的积累量还不够多，一些病原体检出率低，尚不能反映其感染的流行特点，同时缺乏本地区多个季节的数据比较，在后续研究中将逐步完善。