不同制备工艺的海带提取物对黄瓜幼苗促生长作用研究

王鹏远 赵帅 李飞雨 杜春影 迟永洲 沈照鹏 王鹏

(1 中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003; 2 青岛市生物药肥工程研究中心,山东青岛 266717)

随着我国农业生产的发展,过度施用化肥带来的土壤板结退化、肥料利用率低和作物质量下降等问题逐渐凸显,严重制约着我国绿色农业和高质量农业的发展。探寻减肥提质的方法已成为当前趋势,环境友好型生物刺激剂已成为新的热点[1],其中海藻源生物刺激剂约占全球生物刺激剂市场份额的三分之一[2],受到广泛关注。褐藻是商业生产海藻提取物最常用的原料,包括海带、泡叶藻、马尾藻、巨藻等,其中海带在我国藻类养殖业中占有重要地位,2020年我国海带总产量为165万t,占我国藻类总产量的63%[3],因此,是生物刺激剂的理想来源。对海带的高值化应用的研究表明,海带提取物的活性物质种类丰富,包括多糖、蛋白质、酚类化合物、植物激素等,这些物质通过单独或协同作用影响植物的生理生化反应,如促进植物生长和养分吸收,增强植物的抗胁迫能力,刺激叶绿素和植物激素的生物合成[4],还可以重塑根系微生物群落结构、提高土壤的保水能力[5]。多糖是海带中最重要的成分之一,约占海带提取物干质量的10%～30%[6]。多糖能够促进植物生长,有研究表明,在黄瓜幼苗叶片喷施褐藻寡糖可有效促进幼苗的光合作用,提高其抗氧化酶的活力,进而提高黄瓜产量[7]。

目前,在工业上广泛应用的海带提取物的制备工艺有化学酸解法和生物酶解法。不同制备方法会影响提取物的成分和其生物刺激效果[8]。化学酸解法工艺简单,反应较彻底;生物酶解法工艺要求高,但产物活性高,二者各有优势[9]。本研究采用化学酸解法(简称酸法)和生物酶解法(简称酶法)分别制备海带提取物,分析其成分与结构表征,并比较和评价不同制备工艺的海带提取物对黄瓜幼苗生长参数和生化指标的影响,以期为海藻源生物刺激剂的开发和生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

干海带购自山东寻山集团有限公司;黄瓜种子购自江苏南京金丰种苗有限公司;无水乙醇、磷酸氢二钠、氢氧化钾、苯酚、葡萄糖、氯化钾、浓硫酸等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯;褐藻胶裂解酶(1×104U/g)由中国海洋大学食品科学与工程学院应用微生物实验室提供;酶联免疫吸附试验试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 海带提取物的制备

酸解海带提取物(ALE):将干海带磨碎,称取150 g海带粉添加到1 L硫酸溶液(体积分数为2%)中,室温下在5 L发酵罐中搅拌20 min,然后迅速升温至121 ℃,在121 ℃、0.12 MPa条件下持续反应30 min,4 000 r/min离心10 min,用KOH将所得上清液的pH调至7.0,即获得酸解海带提取液[10]。

酶解海带提取物(ELE):将干海带磨碎,称取150 g海带粉溶于2.25 L超纯水中,缓慢加入缓冲溶液(柠檬酸-磷酸氢二钠)将pH调至6.0,加入0.03 g褐藻胶裂解酶(1×104U/g),在30 ℃条件下在5 L发酵罐中保温酶解3 h,4 000 r/min离心10 min后取上清液,即获得酶解海带提取液[11]。

根据不同倍数梯度稀释的预试验结果的规律性和典型性,最终确定将两种海带提取物稀释至可溶性固形物含量分别为0.08、0.12、0.24 g/L(即低、中、高浓度),用于后续试验。

1.2.2 酸解和酶解海带提取物的组分分析

将样品在马弗炉中550 °C下煅烧6 h,根据AOAC法测定灰分含量[12]。以葡萄糖和牛血清白蛋白为标准品,分别用苯酚-硫酸法和福林酚法测定总糖和总蛋白质含量[13]。采用福林酚法测定总多酚含量[14]。采用间羟基联苯法测定海藻酸含量[15]。根据Chi等[12]的方法,使用TSK-GEL G4000 PWxl色谱柱(7.8 mm×30 cm,Tosoh,Shiba,Tokyo,JP)测定样品中多糖的分子量及其分布。

1.2.3 植物培养

将7组(每组21粒)黄瓜种子在25 ℃无菌水中萌发2 d后,将其移入装有土壤的21孔穴盘中,并在光周期16∶8(即光照时长16 h,黑暗时长8 h)、温度为25 ℃、相对湿度为60%、照度为400 μmol/(m2·s)的环境中培养。8 d后,对照组(CK)用1 L蒸馏水进行灌根处理。试验组中,3组分别用0.08 g/L(L-ALE)、0.12 g/L(M-ALE)、0.24 g/L(H-ALE)的酸解海带提取液各1 L进行灌根处理;另外3组分别用0.08 g/L(L-ELE)、0.12 g/L(M-ELE)、0.24 g/L(H-ELE)的酶解海带提取液各1 L进行灌根处理。培养16 d后(黄瓜幼苗展开第3功能叶),收集样品,用于评价指标的测定。

1.2.4 黄瓜幼苗生长参数的测定

测量每组黄瓜幼苗的表观生长参数,包括株高、根长、地上部分鲜质量和根部鲜质量。

1.2.5 叶绿素含量的测定

根据Liu等[8]的方法提取并测定叶绿素,取0.3 g叶片在5 mL 95%乙醇中匀浆,然后在室温下以4 000 r/min离心10 min,上清液用95%乙醇定容至25 mL,并测量649 nm和665 nm处的吸光度。叶绿素a和叶绿素b含量的计算公式如下:

叶绿素a含量=12.71A665-2.59A649

(1)

叶绿素b含量=22.88A649-4.67A665

(2)

式(1)～(2)中:A649表示样品在649 nm处的吸光值,A665表示样品在665 nm处的吸光值。

1.2.6 可溶性糖含量的测定

根据Zou等[16]的方法提取叶片中的可溶性糖。取0.3 g叶片在5 mL蒸馏水中匀浆,然后在100 ℃下加热30 min,过滤后的滤液用蒸馏水定容至25 mL,通过苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量[13]。

1.2.7 可溶性蛋白含量的测定

按照He等[17]的方法提取叶片中的可溶性蛋白质。取0.3 g叶片在5 mL水中匀浆,然后在室温下以4 000 r/min离心10 min,所得上清液用磷酸盐缓冲液定容至10 mL。以牛血清白蛋白为标准,用考马斯蓝在595 nm处测定上清液中的可溶性蛋白质含量[13]。

1.2.8 植物激素含量的测定

取0.1 g幼苗第3功能叶,在0.9 mL提取液(pH为7.4)中匀浆。在4 ℃下以12 000×g离心15 min后,通过酶联免疫吸附试验试剂盒测定上清液中的吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的水平,相应的检测范围为2～48 pmol/L和20～480 ng/L[18]。

1.3 数据处理

使用Minitab 19软件进行数据分析处理,采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)对处理组与对照组的数据进行显著性分析,设显著性水平为0.05。采用GraphPad 8.0.1软件进行绘图制作。

2 结果

2.1 海带提取物组分分析

酸解海带提取物(ALE)和酶解海带提取物(ELE)的化学组分见表1。两种工艺获得的海带提取液中,以海藻酸为代表的多糖含量较高,不同工艺在有效物质的提取率方面有显著性差异,ALE的海藻酸、总蛋白质、多酚和甘露醇的含量均显著高于ELE(P<0.05)。在多糖分子量方面,通过标准曲线计算得出,ALE中多糖的重均分子量为4 209 Da,ELE中多糖重均分子量为2 420 Da(见图1)。

表1 酸解海带提取物(ALE)和酶解海带提取物(ELE)的组分分析

图1 多糖分子量标准曲线以及ALE和ELE中多糖分子量分布

2.2 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗生长指标的影响

由表2可见,与对照组相比,中、高剂量的ALE和ELE对黄瓜幼苗的株高均有显著增效(P<0.05),分别提高了35.0%、32.5%、15.0%和32.5%,其中,高剂量ALE(H-ALE组)作用效果最好;中剂量ALE和ELE对根系生长均有显著促进作用(P<0.05);在鲜质量方面,中剂量ALE和低剂量ELE处理的黄瓜幼苗地上部分鲜质量显著增加,分别增加了66.6%和36.8%,低、中剂量ALE对根部鲜质量有显著促进作用(P<0.05)。

表2 ALE和ELE对黄瓜幼苗表观生长指标的影响

2.3 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗叶绿素含量的影响

由图2可见,与对照组相比,不同ALE和ELE处理组黄瓜幼苗的叶片叶绿素a和叶绿素b含量均显著增加(P<0.05)。其中ALE 3个处理组黄瓜幼苗的叶绿素a含量分别提高了20.3%、9.5%、22.5%,叶绿素b含量分别提高了49.1%、31.5%、44.3%。

注:相同系列数据上标字母不同表示组间差异显著(P<0.05),上标字母相同表示组间差异不显著(P>0.05)。

2.4 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗可溶性糖含量的影响

由图3可见,与对照组(CK)相比,中、高剂量ALE和ELE组可溶性糖的含量均有显著提高(P<0.05),其中,中剂量ALE处理组的可溶性糖含量最高,与对照组相比提高了83.7%。

注:数据上标字母不同表示有显著差异(P<0.05),上标字母相同表示没有显著差异(P>0.05)。

2.5 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗可溶性蛋白质含量的影响

由图4可见,与对照组相比,ALE和ELE均显著提高了黄瓜幼苗中的可溶性蛋白质含量(P<0.05),其中,低剂量ALE的效果最好,可溶性蛋白质含量提高了74.2%。中、高剂量的ELE比同剂量的ALE作用效果更为明显(P<0.05)。

2.6 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗植物激素含量的影响

由图5可见,与对照组相比,各ELE处理组显著提升了黄瓜幼苗GA和IAA的含量(P<0.05),且作用效果均随着剂量的增大而减弱。低剂量ELE处理组对黄瓜幼苗IAA和GA含量的提升效果最佳,分别提升了69.6%和75.8%。

注:数据上标字母不同表示有显著差异(P<0.05),上标字母相同表示没有显著差异(P>0.05)。

3 讨论

ALE中降解多糖的分子量分布较宽,这可能是由于在酸解时糖苷键会随机断裂,共轭酸质子作用于环糖苷键,使碳氧离子键断裂并形成非还原基端,因此获得不均匀的多糖碎片[9]。ELE中降解多糖的分子量呈现正态分布,所用的褐藻胶裂解酶能通过β消除作用于海带中褐藻胶的β-1,4-糖苷键,并在产物非还原端C4和C5之间形成不饱和双键[19],采用这种专一性酶解方式能够获得较为均一的多糖降解片段。

整体来看,ALE对黄瓜幼苗的促生长作用更为明显,这可能与褐藻多酚的作用有关。相关研究证明,将海藻多酚物质应用于玉米叶片的表面和根系,可显著改善玉米的生长指标参数,同时促进植株根、茎、叶的生长,增大叶片面积并提高叶片数及生物量[20]。本试验中,ALE中的多酚含量显著高于ELE,说明ALE的作用效果更优。

叶绿素在光能吸收、转移和光化学电荷分离等方面发挥作用,叶绿素a和叶绿素b的含量、比例、分布可调控叶片的光合作用[21]。其中,ALE的作用效果优于ELE,这可能与ALE中海藻酸和多酚含量更高有关。海藻酸和褐藻多酚已被证实对光合色素合成有积极影响。经海藻酸和多酚处理的烟草和甘蓝叶具有较高的叶绿素以及其他色素含量,为捕光色素蛋白复合物(LHCS)和光系统Ⅱ反应中心(PSⅡRC)的合成提供了原料[22]。

可溶性糖在植物体内可以作为能量物质提供植物生长所需的能量,可以作为信号分子调节内源酶的表达。糖信号与激素信号转导有一定的相互作用,是植物生长评价的重要指标[23]。研究发现,海藻酸通过上调部分光合作用的基因,增强作物光合作用或刺激酶合成等途径,促进了可溶性糖的积累[23-24]。据报道,植物光系统PSⅡ反应中心只有叶绿素a的存在,因而光合作用与叶绿素a含量关系非常密切,但过量的叶绿素积累会引起光氧化损伤[25-27]。本试验中,黄瓜幼苗中的叶绿素含量与可溶性糖含量有一定的相关性,ALE和ELE通过提升叶绿素含量促进了可溶性糖的积累,这种效应已在樱桃、葡萄、番茄、玉米等多种作物中得到证实[20]。

可溶性蛋白质是植物中氮的主要形式,它在植物的生长发育中起着重要作用,是反映植物整体代谢状态的多种酶的重要组成部分[28]。已有研究表明,海藻提取物能够提高甜玉米对氮素的利用率,促进可溶性蛋白质积累,提高玉米产量[29]。据报道,海藻寡糖可提高植物体内硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶的活性,使更多的NH4+转化成有机氮进入氮代谢循环,有利于蛋白质的积累[10]。

GA和IAA是调控植物生长发育的重要激素,对细胞的分裂、伸长和分化都有一定的作用,同时,IAA有诱导调控维管束分化、调控根的分化形成、促进果实发育等功能[30]。褐藻提取物已经被证明用于植物中可以调节参与细胞分裂素、脱落酸和赤霉素生物合成的基因的表达,通过调节植物激素活性影响植物生长[31]。相关研究发现,富含分子量为1.8 kDa和2.7 kDa多糖的褐藻提取物能够提高黄瓜幼苗叶片中GA和IAA等植物激素的水平[10]。本试验中,ELE中多糖分子量为2 420 Da,对植物激素合成有更好的促进作用。有研究表明,当GA质量浓度在0～200 mg/L时,随着浓度的增加,GA对黄瓜幼苗生长的促进作用增强,但当GA质量浓度在200～350 mg/L时,随着浓度的增加,GA对黄瓜幼苗生长的抑制作用增强;IAA的作用同样具有两重性[32]。本试验中,ELE更有利于植物激素合成,但ALE对黄瓜幼苗的促生长作用更优,原因可能是高浓度的植物激素对黄瓜幼苗的生长会起到抑制作用。

4 结论

不同工艺制备的海带提取液对黄瓜幼苗均有促生长作用,在不同指标方面的表现各异。在表观生长指标方面,ALE表现出更好的促进作用,且中剂量ALE作用效果最佳。这可能与相关激素的两重性有关。在生化指标方面,ALE对叶绿素含量的促进作用优于同剂量的ELE,两种提取液均能提高可溶性蛋白质和可溶性糖的含量。ELE组能显著提高黄瓜幼苗的GA和IAA含量,且低剂量的ELE生物刺激效果最佳,较对照组分别提升了69.6%和75.8%。在实际的海带源生物刺激剂的开发和生产过程中,建议根据产品的不同用途选择合适的生产方式。