植物细胞程序性死亡中的半胱氨酸蛋白酶研究进展＊

王东方，曹 慧

（山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室 潍坊学院，山东 潍坊 261061）

程序性死亡或细胞凋亡（programed cell death，PCD）是多细胞生物体中一些细胞所采取的一种由自身基因调控的主动死亡方式［1］。近年来随着动物和医学中细胞凋亡的深入研究，植物的PCD 研究也成为植物学研究的热点领域。许多研究表明，在众多的环境胁迫例如干旱、高低温和盐碱胁迫下半胱氨酸蛋白酶mRNA 会积累［2-3］，在植物发生PCD 的某些发育阶段过程中半胱氨酸蛋白酶mRNA 也会增加，这说明半胱氨酸蛋白酶（Caspase）与植物发生PCD 有关［4］。

1 Caspase的基本结构和分类

半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase），是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白，是富含半胱氨酸的一类蛋白酶家族，它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割，从而造成细胞凋亡。Caspase蛋白家族是细胞自杀机制的主要“执行者”，Caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的启动细胞死亡程序的执行阶段［5］。Caspase以前体形式合成，Caspase前体是由两个亚单位组成的异二聚体，每个有活性的Caspase均来自于两个前体的加工与结合，其后再形成异四聚体。Caspase活化经两次裂解，裂解位点均在天冬氨酸羟基端肽键，蛋白酶前体被切断成三部份，H2N-端是抑制区域被移去，另一端COOH-端断裂成一大一小亚单位称为死亡区域，在每个二聚体内大小亚单位相嵌形成一个以p片层组成的核心，两侧有α螺旋，两大两小亚单位再结合成活化酶，该四聚体在分子对应的两端有两个活性位点，可作用于其自身和其他Caspase酶原，按顺序依次激活Caspase，形成信号传导机制的酶级联反应［6-7］。这种连锁反应的进行有赖于Caspase的调节蛋白、辅助因子、反馈关系和阈限等控制。

Caspase有多种，多数和凋亡有关，少数和炎症有关［8］。根据Caspase在级联反应上下游的位置及功能的不同可将Caspase家族大致分为两种类型：I型Caspase，又称为启动型Caspase（Initiator Caspase），包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等，位于Caspase级联反应的最上游，能在其他蛋白辅助因子的参与下发生自我活化并激活下游的Caspase；Ⅱ型Caspase，又称为执行型Caspase（Executioner Caspase），包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，其作用在于特异性地裂解底物使细胞发生生化及形态学改变，最终导致细胞凋亡。除此之外，还有一类Caspase包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-13、Caspase-14等，主要参与细胞因子介导的炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用［9］。

2 Caspase参与了植物PCD 的过程

Caspase的研究源于线虫（C.elegans）细胞程序化死亡的研究，是哺乳动物PCD 启动和执行阶段的关键调节因子，植物中虽然没有分离出caspase基因，但是在植物细胞死亡过程中检测到caspase活性的提高，已有证据表明植物细胞凋亡过程中发生半胱氨酸蛋白酶的活化，推测其分子结构与动物不同，在PCD中执行的功能也可能不同［10］。用动物Caspase活性分析试剂盒检测到湖北海棠根系存在Caspase-3或Caspase-7活性［11］；研究苹果砧木新疆野苹果和平邑甜茶细胞程序性死亡时，通过蛋白免疫印迹实验发现干旱胁迫条件下两种苹果叶片都有类Caspase-3蛋白酶的发生，而根中没有，通过Western bolt检测出类Caspase-3的分子量大约是40KD，比动物的类Caspase-3的分子量（32KD）大8KD 左右［12］。

2.1 植物Caspase的种类

序列分析表明，在拟南芥基因组中，没有编码Caspase酶类的基因，但是在正在死亡的植物细胞中可以检测到Caspase活性的升高，说明植物细胞程序性死亡过程依靠的是具有Caspase酶活性的其它种类的蛋白酶。基因组序列比对表明，植物中的某些序列编码的蛋白酶与Caspase在空间结构上具有一定的相似性，而且常用的Caspase酶类抑制剂可抑制其活性。在用menadione诱导烟草原生质体细胞程序性死亡的研究中发现，Caspase的抑制剂Ac-DEVD-CHO 和Ac-YVAD-CHO 可以阻止DNA 的断裂和PARP（poly-（ADP-ribose）polymerase）的降解［13］。目前，植物中已鉴定出来的半胱氨酸蛋白酶可以分为三类，其中豆类天冬氨酸蛋白内切酶（1egumain）家族的液泡加工酶（vacuolar processing enzymes，VPEs）和metacaspase属于半胱氨酸内肽酶，它们在氨基酸序列及空间结构上与Caspase具有相似性，是Caspase的同系物；丝氨酸内肽酶（saspases）属于枯草杆菌丝氨酸蛋白酶，可以裂解人工合成的Caspase底物。最近的研究表明，VPEs、metacaspase和saspases在植物细胞程序性死亡过程中均起到类似Caspase酶类的关键性调控作用，参与调控植物PCD。

2.2 动植物Caspase的异同

与动物细胞凋亡重要组分Caspase相似，植物半胱氨酸蛋白酶也参与植物细胞死亡的调控。Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）参与H2O2诱导的植物PCD，而植物PARP的降解依赖于细胞色素C释放到胞质中，可被特异的Caspase-3抑制剂所抑制［14］。

动植物中的半胱氨酸蛋白酶的区别主要有以下两点：（1）亚细胞结构中的定位不同，植物半胱氨酸蛋白酶定位于液泡和细胞壁，叶绿体中的半胱氨酸蛋白酶可以降解Rubisco，而动物Caspase蛋白酶活性仅存在于细胞质中，而不存在于液泡中；（2）同源性较低，研究表明，植物中的半胱氨酸蛋白酶从基因编码到蛋白质结构和功能与动物Caspase蛋白家族相比均呈现出较低的同源性，所以对植物中是否真正存在与动物相似的由半胱氨酸蛋白家族介导的PCD 调控与执行机制还存在争议。

2.3 植物Caspase及其编码基因

尽管对于半胱氨酸蛋白酶如何被生长发育或外部刺激信号激活，以及其如何参与调控细胞死亡的具体过程还不清楚，但关于半胱氨酸蛋白酶，已经从许多植物中成功的分离出其编码基因，根据植物半胱氨酸蛋白酶的基因表达特点可将其分为三类。

2.3.1 存在于植物正常发育过程中或在植物某些特殊时期表达的半胱氨酸蛋白酶

Carne和Moore从中华猕猴桃（Actinidia chinensis）果实中分离到了一种半胱氨酸蛋白酶，并得到了其氨基酸序列，即actinidain［15］。Mbeguie等在研究杏树果实成熟时发现一个编码半胱氨酸蛋白酶基因高度表达，并成功提取其mRNA，为今后的研究提供了基础［16］。Lee等分离到水稻半胱氨酸蛋白酶基因OsCP1，通过表达模式分析发现OsCP1基因在水稻花药绒毡层及未成熟的花药中表达，T-DNA 插入突变体分析发现其主要参与水稻花粉发育过程［17］。严秀蕊等在水稻发育过程中发现半胱氨酸蛋白酶相关基因OsCP2，其也在水稻花药绒毡层及未成熟的花药中表达，且只在花粉发育的空泡花粉时期到成熟时期进行表达［18］。张红岩等采用SSH（Suppression subtractive hybridization）和Race-PCR（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆得到来自甘蓝型油菜（Brassica napus L.）矮化突变体‘NDF-1’的一个半胱氨酸蛋白酶相关基因Bncp5，相对定量RT-PCR 检测表明此基因具有组织表达特异性［19］。Tripathi在玫瑰花瓣脱落过程中发现转录激活一个37KD 的伴随乙烯反应的半胱氨酸蛋白酶基因RbCP1，该基因与蛋白质的降解过程联系密切［20］。张国林等在花生果种皮中发现一个半胱氨酸蛋白酶基因AhPSG13，RT-PCR 检测表明该基因在果种皮中特异表达［21］。

2.3.2 在生物胁迫和非生物胁迫条件下诱导表达的半胱氨酸蛋白酶

在对拟南芥的逆境研究中发现了RD（responsive to dehydration）系列基因，包括rd19A 和rd21A 以及rd29A／cor78／lit78［22］。RD 系列基因已经成为逆境研究中的重点，对于逆境信号转导路径的交叉研究具有重要意义。臧庆伟以水分胁迫24h的cDNA 文库中WSI-V-F10克隆的EST 为基础，通过RACE方法获得了小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaCP（AY841792）［23］。朱家红从橡胶树胶乳中克隆了一个半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1（DQ642886），半定量RT-PCR 结果显示，乙烯和伤害诱导胶乳HbCP1基因的表达，推测胶乳中的HbCP1 蛋白可能具有防御功能［24］。曹慧等在苹果属植物八棱海棠中也克隆到了Caspase基因［25］。

2.3.3 在衰老的植物器官表达量增加或在衰老时期特异表达的半胱氨酸蛋白酶

由于衰老也是一种主动的、内在因子调控的有序过程，并且与细胞死亡相关，有时将衰老视为程序化死亡过程［26］。在各种衰老的植物器官中分离到了许多编码半胱氨酸蛋白酶的基因，它们被称作衰老相关基因SAG（senescence associated genes），如拟南芥的SAG2和SAG12，玉米的See1和See2，油菜的LSC7和LSC790［27］，番茄的Cyp23［28］和烟草的NTCP223［29］，这些基因在衰老的叶片中均被上调。王勇等在研究大豆叶片衰老过程中发现了一个半胱氨酸蛋白酶相关基因，其在衰老的叶片中特异性表达［30］。沈法富等从辽棉9号衰老叶片中克隆了编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA，命名为Ghcysp（AY604196），基因表达分析表明，该基因在棉花的根、下胚轴、花、胚珠和幼叶中不表达，而在棉花的衰老叶片中特异性表达［31］。朱海生等在草莓中克隆岛半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，并发现随着衰老程度的增加，FaCP 基因表达量逐渐增加，特别在衰老后期，显著上升［32］。花椰菜花瓣衰老过程中半胱氨酸蛋白酶比对照也有显著表达［33］。

3 结束语

半胱氨酸蛋白酶作为一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的各种生理过程。半胱氨酸蛋白酶参与贮藏蛋白的降解，在响应逆境胁迫时负责蛋白的周转；参与响应病菌侵袭时的超敏反应；参与木质部分化和器官衰老引发的PCD。半胱氨酸蛋白酶基因不仅与植物的衰老相关，同时也参与信号传导响应外界环境中的生物和非生物胁迫［14，34］但在植物响应非生物胁迫和生物胁迫以及器官分化和衰老的过程中，半胱氨酸蛋白酶的功能仍不够明确，caspase酶类在植物中的真正功能还不清楚，有关植物细胞程序性死亡蛋白酶的研究尚处于起始阶段，但随着动物细胞凋亡研究的深入，将会进一步揭示植物细胞程序性死亡中caspase酶类作用机理和机制。

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