正交实验确定Alcalase水解大豆蛋白的最佳实验条件＊

孙显慧

（潍坊职业学院，山东 潍坊 261041）

大豆蛋白质的水解方法可分为酸水解、碱水解和酶水解法等多种方法，由于酸碱水解方法存在许多不足之处，如营养成分损失，水解无特异性，副反应多，水解产物感官性能差，反应条件不易控制等，所以在这方面的研究不是太多。相比而言酶解反应条件温和，反应易于控制，反应过程中营养物质的破坏较小，因此，从1970年代起，日本和美国的研究学者就开始致力于酶水解生产大豆蛋白水解产物的研究。在我国，从1980年代起也有一些科研人员开始研究大豆多肽的酶解法生产。目前为止，酶法水解大豆蛋白质生产大豆多肽成了研究的一个重要方向，用于研究大豆蛋白水解的酶主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶及微生物蛋白酶等；由于各种不同的酶对蛋白质作用的位点不同，得到的产物也就不同，不同的酶也可能给产品带来不同的风味，甚至带来难以除去的苦味。近几年来，有人用微生物发酵技术制备大豆肽［1］，这种方法将酶的生产和应用合二为一，省去了中间步骤，不需要添加额外的酶就可以生产出大豆肽，大大降低了成本，这种制备技术成了大豆多肽研究的一个新的方向。

本研究利用枯草杆菌蛋白酶Alcalase对大豆分离蛋白进行水解，得到大豆多肽粗溶液。酶的水解过程往往受到水解的底物、温度、pH值及酶浓度等多种条件的影响。本研究主要通过正交实验来确定蛋白酶Alcalase对大豆分离蛋白的最佳水解条件。

1 材料与方法

1.1 实验原料与主要试剂

大豆分离蛋白粉（蛋白含量91%）（山东济南冠力科贸公司）；枯草杆菌碱性蛋白酶Alcalase2.4L（粉末状颗粒，标注酶活力2.4Au／g，济南百泰生物酶制剂有限公司）；6mol／L HCl溶液（分析纯）；5mol／L NaOH溶液（分析纯）。

1.2 仪器设备

凯氏定氮装置（定制）；HH－6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；精密增力电动搅拌器（常州国华电器有限公司）；酸度计PHS－2型（上海雷磁仪器厂）；721分光光度计（上海第三分析仪器厂）；LXJ－Ⅱ型离心沉淀机（福州医疗器械厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆分离蛋白酶水解工艺

称取一定量大豆分离蛋白→溶解至一定浓度→90℃预处理→冷却至酶适宜温度→用5mol／L的NaOH溶液调酶适pH值→放入以预热的恒温水浴锅→搅拌→加入一定量的酶制剂，并用5mol／L的NaOH溶液保持反应的pH值恒定→反应结束，85℃下灭酶15min→冷却至50℃以下，用6mol／L的HCl溶液调至pH4.2→离心分离得上清液。

在蛋白酶水解的过程中应严格控制水解的温度、pH值，尽量保持其水解条件恒定，以使酶水解在酶的最佳反应条件下进行。

1.3.2 酶解反应条件的优化

酶水解反应结果受反应温度、底物、酶浓度、反应pH值及反应时间的影响，为了确定最佳酶解反应条件，首先采用单因素多水平进行实验，筛选出影响酶反应各因素的最佳条件（另文整理）；根据各因素的最佳条件，列出正交实验表进行正交实验，以确定各因素对酶解反应的相互影响作用，最终确定酶解反应的最佳条件。

1.3.3 大豆分离蛋白水解度的测定

大豆分离蛋白酶水解液水解度的测定采用茚三酮显色法［2］。

标准曲线的制作：取干燥过的甘氨酸0.1g，溶解后定容至100mL，取2.00mL定容至100ml，得20ug／L的溶液。分别稀释成含量为2－20ug／L系列溶液，同时作空白样。取2.00mL测定稀释液于试管，加入1.00mL茚三酮，混匀后置于沸水浴中加热15min后用冷水冷却20min加入5.00mL的40%乙醇混匀，放置15分钟后用1cm比色杯于570nm测吸光值A，并绘制A－C关系曲线。

样品测定：取0.5mL水解蛋白溶液定容至50mL，取0.4mL稀释液移入试管中并加入l.6mL蒸馏水，混匀，加入1mL茚三酮显色剂，混匀后置于沸水浴中加热15min后用冷水冷却（同时作空白），加入5.00mL的40%乙醇溶液混合，放置15min后用1cm比色杯以空白管于570nm调零测吸光值A，以此算出－NH2的含量（mmol／L）。

水解度DH计算：

其中，0.33umol／g：原料大豆蛋白中－NH2的含量；7.8umol／g：每克原料大豆蛋白中肽键的毫摩尔数。

2 结果与讨论

2.1 单因素多水平的研究

物浓度、酶浓度、反应温度、反应pH值及反应时间等对Alcalase蛋白酶水解反应结果的影响已另文整理，在此省略。

研究发现上述各个因素对反应有着不同程度的影响，但是对反应影响程度的大小不同。但是从各因素对反应的水解度DH及蛋白质回收率的影响基本上呈现相同的趋势。因此可以取水解度或蛋白质回收率为指标，进行正交实验，以确定酶水解反应的最适条件。

2.2 正交实验确定Alcalase蛋白酶水解反应最佳条件

影响酶反应的几个主要因素为底物浓度、酶浓度、反应温度、反应pH值及反应时间等，根据以上单因素结果分析，考虑到对生产效率的影响，底物浓度采用8%、反应时间2h，选择反应温度、pH值、酶浓度为三个影响因素分别取三个水平，同时以水解反应的蛋白质水解度为指标进行正交实验，正交因素水平见表见1，正交实验结果见表2。

表1 L9（33）正交实验因素水平表

表2 L9（33）正交实验结果及极差分析表

从以上分析可以得出，各因素对实验指标（DH）的影响按大小次序来说应该是A（温度）＞C（酶浓度）＞B（PH），最好方案是：A2C2B2，即温度60℃，酶浓度（E／S）3.6Au／100g底物，反应PH8.0。

在正交实验中没有出现分析出来的最优方案，与它接近的是第4、5号实验，在第4号实验中只有PH值不处在最好水平，第5号实验中酶的浓度不是处于最好水平，但是PH的影响是三因素中最小的，酶浓度对水解度的影响远远小于温度的影响，而且实验做出的结果中第4、5号实验结果接近，水解度分别为19.3%和21.0%，是9个平行实验中的水解度数值最高的两个。第5号实验酶的用量增大使水解度增大，取本实验为最佳实验会很大程度上提高生产成本。因此选择温度T：60℃，酶浓度（E／S）：3.6Au／100g底物，PH8.0为最优实验方案。

3 结论

利用Alcalase蛋白酶水解大豆分离蛋白，底物浓度采用8%、反应时间2h，选择反应温度T、PH值、酶浓度为三个影响因素分别取三个水平，以水解反应的蛋白质水解度为指标进行三因素三水平的正交实验。通过正交实验确定了Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白得到大豆多肽溶液的最佳实验条件：底物浓度8%，酶浓度（E／S）3.6Au／100g底物，温度60℃，PH8.0。

［1］赵芳芳，张日俊.大豆肽的功能及其在畜牧业中的应用前景［J］.兽药与饲料添加剂，2003，（8）：17－18.

［2］郭兴凤.蛋白质水解度的测定［J］.中国油脂，2000，25（6）：176－177.