杜仲叶提取绿原酸的工业化生产工艺优化

雷燕妮，张小斌，李多伟

（1.商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000；2.商洛学院健康管理学院，陕西商洛 726000；3.西北大学生命科学学院，陕西西安 710069）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是一种名贵药材，在秦岭山区中广泛生长。杜仲叶中含有有效成分绿原酸（chlorogenic acid）[1]。绿原酸具有抗菌、利胆、降压及兴奋中枢神经系统等作用，有助于治疗非胰岛素依赖型糖尿病，并被用作抗HIV病毒的先导化合物，是医药、保健品、食品等行业的重要原料[2-7]。目前利用杜仲叶提取分离绿原酸的研究报道较多[8-22]，但杜仲叶提取分离绿原酸的工业化生产工艺研究报道甚少。本文以杜仲叶为原料，研究提取分离绿原酸的工业化生产工艺参数，从提取、浓缩、分离、干燥等各个环节寻找最佳的工艺路线及设备选择，提高绿原酸的提取率、有效成分的含量，降低生产成本，为工业化生产提供可借鉴技术参数，也为秦岭山区杜仲的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

杜仲叶：采自秦岭山区，商洛学院健康管理学院张小斌教授鉴定。

1.2 试剂与仪器

绿原酸对照品（上海同田生化技术有限公司购买，纯度>98.0%）；HPLC测定用溶剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

VS-100UE恒温超声波提取机（无锡沃信仪器制造有限公司）；R-1050旋转蒸发器（常州亚旺仪器有限公司）；SHZ-DIII水式多用真空泵（上海予英循环水式真空泵实验室蒸馏）；KRT-D-NF/UF/FO多功能膜设备（合肥科瑞特膜设备有限公司）；U3000高效液相色谱仪（Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 杜仲叶中绿原酸含量的测定方法

色谱条件Kromasil-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈：0.4%磷酸溶液（13：87）；柱温30℃；检测波长327 nm；进样量10 μL[1]。

1.3.2 杜仲叶提取绿原酸的提取工艺

1）提取方法与提取溶剂的优选

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，为苯丙素类化合物。它的半水合物是一种针形的结晶（水），在温度达到110℃时呈现无水化合物的状态。绿原酸在热水中的溶解度稍大，较易溶解在乙醇和丙酮中，极少数可以溶解在醋酸乙酯中，非常难溶解在三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂中。本研究采用水、乙醇超声提取和热回流提取进行对比试验。

热回流提取法：精确称取杜仲叶粉末5.00 g，4份，分别置于250 mL烧瓶中，再分别加入水、55%乙醇、75%乙醇和95%乙醇各75 mL，在水浴温度85℃下回流提取2.0 h，离心，上清液用各自溶剂定容至100 mL，溶液中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

超声提取法：精确称取杜仲叶粉末5.00 g，4份，分别置于250 mL烧瓶中，再分别加入水、55%乙醇、75%乙醇和95%乙醇各75 mL，超声提取1.0 h，离心，上清液用各自溶剂定容至100 mL，溶液中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

2）超声水提杜仲叶绿原酸的正交试验方法

为探讨超声水提各工艺参数相互交叉的影响，设计四因素三水平的正交试验进行验证，见表1。

表1 超声水提杜仲叶绿原酸的正交试验因素表

3）杜仲叶提取绿原酸的浓缩工艺方法

精确称取杜仲叶粉末50.00 g，4份，分别置于2 000 mL烧瓶中，其中两份各加入500 mL水，另两份各加500 mL 75%乙醇，超声提取45 min，粗滤，残渣再提取1次，粗滤，合并两次滤液，离心，其中一份水提液和一份醇提液用旋转真空浓缩器进行浓缩，另外一份水提液和一份醇提液用膜浓缩器进行浓缩，浓缩液用各自溶剂定容至100 mL，浓缩液中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

4）杜仲叶提取绿原酸的干燥工艺方法

精确称取杜仲叶粉末50.00 g，4份，分别置于2 000 mL烧瓶中，各加入500 mL水，超声提取45 min，粗滤，残渣再提取1次，粗滤，合并两次滤液，离心，上清液用膜浓缩器进行浓缩，各浓缩液分别用真空干燥、微波干燥、喷雾干燥和连续低温真空干燥，干燥产品中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

1.3.3 工业化生产验证试验的方法

方法一：称取杜仲叶粉末500 kg，置6 m3多功能提取罐中，加入4 000 mL水，热回流提取120 min，粗滤，残渣再提取1次，粗滤，合并两次滤液，板框过滤，滤液用外循环真空浓缩器浓缩，喷雾干燥，产品中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

方法二：称取杜仲叶粉末500 kg，置100 kg/h连续逆流超声提取装置中，用4 000 mL水，超声提取45 min，粗滤，板框过滤，滤液用外循环真空浓缩器浓缩，喷雾干燥，产品中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

方法三：称取杜仲叶粉末500 kg，置100 kg/h连续逆流超声提取装置中，用4 000 mL水，超声提取45 min，粗滤，板框过滤，滤液用膜浓缩装置浓缩，低温刮板浓缩器进一步浓缩，用连续低温真空干燥装置干燥，产品中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定。

2 结果与分析

2.1 提取方法与提取溶剂对杜仲叶中绿原酸提取率的影响

由表2可知，在热回流法中，绿原酸的提取能力为75%乙醇>55%乙醇>95%乙醇>水，所以，确定75%乙醇作为回流提取试验的提取溶剂。在超声法中，绿原酸提取能力为75%乙醇>95%乙醇>55%乙醇>水，但水提与醇提效果相差不大，从经济的角度，选用水作为提取溶剂，既经济、来源方便，又不会对环境产生影响，所以，选用水作为超声提取试验的提取溶剂。

表2 不同提取溶剂对杜仲叶中的绿原酸提取率的影响（n=3）

由表3可知，对绿原酸而言，75%乙醇超声提取率略大于水超声提取率。水超声提取和热回流提取绿原酸差别很大，水超声提取率比热回流提取率提高85.3%。醇超声提取和热回流提取绿原酸差别不大。从经济效益考虑应采用水超声提取为最佳。超声提取方法具有提取效率高，温度低，时间短的突出优点，在生产中既可大大节约生产时间，降低生产成本，又可减少温度对热敏物质绿原酸的破坏作用。

表3 不同提取方法的杜仲叶中绿原酸含量的比较（n=3）

2.2 超声水提杜仲叶中绿原酸的正交试验

表4为超声水提正交表L9（34）及结果，表5为超声水提绿原酸提取率的直观分析结果，表6为超声水提绿原酸方差分析结果。

表4 超声水提杜仲叶中绿原酸的正交试验结果

从表5直观极差分析可知，四个因素的极差顺序为A＞B＞C＞D，A因素极差最大，说明对绿原酸提取率而言，A＞B＞C＞D。可见，A 因素影响最大。从表6方差分析结果可知，有显著意义的为A、B因素，无显著意义的为C、D因素。根据各因素k的变化率得出，A因素选水平2，B因素选水平2，C因素选水平3，D因素选水平3，因C因素的水平2和水平3相差不大，但生产中水平3会增加生产用时，增加生产成本，因D因素的水平2和水平3相差不大，但生产中水平3会增加生产用水量，造成后续浓缩工序能源的消耗，增加生产成本，故超声水提绿原酸的条件确定为A2B2C2D2，即用水作为提取溶剂，在料液比为1：10（g：mL），提取温度为 50 ℃的条件下，超声提取2次，每次45 min。

表5 超声水提杜仲叶中绿原酸提取率的极差分析

表6 超声水提杜仲叶中绿原酸提取率的方差分析

2.3 杜仲叶提取绿原酸的浓缩工艺

由表7可知，对绿原酸而言，醇外循环真空浓缩损失远小于水外循环真空浓缩，醇膜浓缩损失略小于水膜浓缩；水溶剂膜浓缩效果远优于外循环真空浓缩；醇溶剂膜浓缩效果略优于外循环真空浓缩。从经济效益考虑应采用水超声提取，膜浓缩为最佳。膜浓缩具有减少温度对热敏物质绿原酸破坏的明显作用。

表7 提取液不同浓缩方法的杜仲叶提取绿原酸含量的比较（n=3）

2.4 杜仲叶提取绿原酸的干燥工艺

由表8可知，对绿原酸而言，连续低温真空干燥优于微波干燥、喷雾干燥和真空干燥；微波干燥与喷雾干燥相近，都优于真空干燥。这主要是热敏物质绿原酸在真空干燥中长时间处于60～70℃，而遭到严重破坏；在喷雾干燥中虽然是超过100℃的高温，但是瞬间遇热，破坏相对少一些；微波干燥同样虽然是温度较高，但干燥时间短，破坏相对少一些；连续低温真空干燥，干燥温度为40～45℃，温度低不会给绿原酸造成破坏，而且在干燥器中停留时间短，因此对绿原酸具有较好的干燥效果。

表8 浓缩液不同干燥方法的杜仲叶提取绿原酸含量的比较（n=3）

2.5 验证试验

精确称取杜仲叶粉末500.00 g，3份，分别置于10 000 mL烧瓶中，各加入5 000 mL水，超声提取45 min，粗滤，残渣再提取1次，粗滤，合并2次滤液，离心，上清液用膜浓缩器进行浓缩，浓缩液用连续低温真空干燥，干燥产品中绿原酸的含量按照药典杜仲HPLC法测定，结果见表9。

由表9可知，验证试验结果表明，超声水提、膜浓缩及连续低温真空干燥工艺可明显提高绿原酸的提取率和含量，方法稳定、可靠。

表9 杜仲叶提取绿原酸的优化工艺验证试验

2.6 杜仲叶提取绿原酸的工业化生产验证试验

由表10可知，在杜仲叶提取绿原酸的生产中，生产线设备的选型是极其重要的，建议在杜仲叶提取绿原酸的生产中，采用连续逆流超声提取装置进行提取，膜浓缩装置进行浓缩，用低温刮板浓缩器进一步浓缩后，用连续低温真空干燥装置进行干燥，采用这样的生产线，杜仲叶绿原酸提取率在20%以上，绿原酸含量在10%以上，杜仲精粉色泽浅，苦涩轻，无沉淀，易溶解。

表10 杜仲叶提取绿原酸的优化工艺工业化生产验证试验

3 讨论与结论

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸,是植物在有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质。绿原酸除极易溶于乙醇外，还易溶于水、甲醇、丙酮等溶剂中，难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂。绿原酸属于热敏成分，温度、光照对其提取分离影响很大。

本研究通过单因素试验及正交试验对杜仲叶粉末提取、浓缩、干燥各工段工艺进行对比试验，并按最佳工艺进行了验证试验。从杜仲叶中提取绿原酸的工艺，在热回流提取过程中，醇热回流提取率明显高于水热回流提取率。在超声提取过程中，醇超声提取率与水超声提取率差别不大。在外循环浓缩过程中醇溶剂中绿原酸损失远远小于水溶剂中的绿原酸，在膜浓缩过程中醇溶剂中绿原酸损失和在水溶剂中的绿原酸几乎无差别，但两者都远远小于外循环浓缩中绿原酸的损失。在干燥过程中，连续低温干燥优于微波干燥、喷雾干燥和真空干燥，微波干燥与喷雾干燥相近，都优于真空干燥。因此从杜仲叶中提取绿原酸最佳工艺为水超声提取，膜浓缩，连续低温真空干燥、微波干燥或喷雾干燥。

本研究确定了杜仲叶提取绿原酸工业化生产最佳工艺为：用水作为提取溶剂，在料液比为1：10，提取温度为50℃的条件下，超声提取2次，每次45 min，滤液通过膜浓缩，再经过连续低温真空干燥，绿原酸转化率在85%以上。此工艺具有操作简单、省时、省溶剂，尤其是在热敏物质绿原酸的保护中显示出突出的优点。

在杜仲叶提取绿原酸的工业化生产中，采用连续逆流超声提取装置进行提取，膜浓缩装置进行浓缩，用低温刮板浓缩器进一步浓缩后，用连续低温真空干燥装置进行干燥这样的生产线生产，突显其工艺及设备的优越性。

本研究仅仅就杜仲叶中有效成分绿原酸这一指标进行考察，杜仲叶中有效成分除绿原酸外，还有京尼平甙酸、桃叶珊瑚甙、松脂醇双糖甙等，这些成分在不同提取工艺中提取率的变化，还有待进一步研究。