五味子乙素提取及其复合保鲜剂的研究

陈月星，徐愉聪，张晓虎

（商洛学院生物医药与食品工程学院/陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西商洛 726000）

南五味子（Kadsura longepedunculata）[1]，是南五味子属，系陕南山区商洛市主产的量大质优的“五大商药”之一[2-3]。南五味子的成熟果实性温且兼具甘、酸、辛、苦、咸五味，不仅作为传统大宗道地中药材得到广泛应用，而且提取分离其功能性成分并探索在食品中的应用成为食品科学领域的研究热点[4-6]。南五味子中的五味子乙素（Schisandrin B）对中枢神经系统、肝脏具有保护作用[7]，能降低动物体内谷丙转氨酶活性，减轻四氯化碳中毒对肝脏的损害，同时具有一定的抗氧化抑菌和降低自由基影响的作用[8]，可使机体抗氧化能力增强，使脂质过氧化损伤降低[9]。已有研究表明五味子乙素除诸多药用价值外，极具成为天然食品防腐保鲜剂的潜力[1，4-6]。本研究选取商洛南五味子为材料，采用乙醇浸提法提取其果实中的五味子乙素，在单因素的基础上，采用响应面法优化提取工艺。设计由五味子乙素溶液、维生素C、柠檬酸及黄原胶为主要成分的复配保鲜剂的优化组合方案，并将制备的复合保鲜剂用于鸡蛋贮藏保鲜，以期为商洛南五味子在食品防腐保鲜中的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

南五味子果实，2021年8月在陕西省商洛市山阳县高坝镇采摘；当天所产新鲜鸡蛋，购于商洛市商州区沙河子镇养鸡场；一次性泡沫包装盒，购于商洛市商州区客都超市。

1.2 供试菌种

大肠杆菌（Esherichiacoli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均购自西安市长安区瑞昇化玻仪器供应站。

1.3 方法

1.3.1 五味子乙素的提取与测定

1）材料预处理

将南五味子新鲜果实置于60℃电热恒温箱中烘干至恒重，粉碎后过40目筛，密封备用[10]。

2）五味子乙素的标准曲线

准确称取五味子乙素标准品10 mg，甲醇定容至50 mL容量瓶内，所得五味子乙素标准溶液浓度为0.2 mg/mL。分别精密吸取0.2 mg/mL的五味子乙素标准品溶液 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇定容。

高效液相色谱法检测不同浓度五味子乙素标准溶液[11]。条件为：波长254 nm、流动相为甲醇：水（90：10）、进样量 20 μL、柱温 25 ℃、流速1.0 mL/min。标准曲线回归方程为：Y=153118x-86537，R2=0.9995，线性关系良好。

3）五味子乙素的提取

精确称取5 g南五味子果实粉末，按料液比1：8加入85%乙醇溶液，在70℃水浴条件下浸提2 h，提取完成后用抽滤机抽滤，滤液即南五味子中五味子乙素待测液。

4）五味子乙素的测定

精密吸取五味子乙素待测液30 mL，甲醇定容至100 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，然后吸取1.0 mL于进样瓶中，检测其在254 nm处的峰面积，外标法计算得到五味子乙素提取率[12]。

5）五味子乙素提取的单因素试验

分别探讨乙醇体积分数（75%，80%，85%，90%，95%）、料液比（1：4，1：6，1：8，1：10，1：12（g：mL））、提取温度（50℃，60℃，70℃，80℃，90℃）及提取时间（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h），4 个因素对南五味子中五味子乙素提取率的影响。

6）五味子乙素提取的响应面试验

选取单因素试验中对五味子乙素提取率影响显著的三个因素，以单因素试验中各因素的最适合条件为中心点，实施三因素三水平设计，利用Design-Expert8.0.6软件对提取工艺进行数学建模，得到最优工艺参数，见表1。

表1 五味子乙素提取的因素水平表

7）五味子乙素提取的验证试验

按6）优化工艺条件，取平行试验中五味子乙素提取率的平均值与预测值比较，评价模型与试验的拟合程度[13-14]。

1.3.2 五味子乙素的抑菌性

采用胥春霞等[15]的方法对五味子乙素提取液进行分离纯化，制备成五味子乙素母液10mg/mL，并配置系列浓度溶液（2.000 0，1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5，0.031 3，0 mg/mL） 进行五味子乙素抑菌效果试验。应用牛津杯法，测定不同浓度五味子乙素溶液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌三种供试菌种的抑菌效果，将能产生抑菌圈的最低浓度确定为五味子乙素对该菌的最低抑菌浓度（MIC）[16]。

1.3.3 复合保鲜剂配方优化

1）复合保鲜剂配方制备的单因素试验

分别探讨Vc含量（0.15，0.18，0.21，0.24，0.27 g）、柠檬酸含量（0.36，0.39，0.42，0.45，0.48 g）、黄原胶含量（0.09，0.12，0.15，0.18、0.21 g）及 2 mg/mL五味子乙素溶液的体积（9，10，11，12，13 mL）四个因素对复合保鲜剂保鲜效果的影响。

2）复合保鲜剂配方的正交试验

采用 L9(34)正交试验设计表对复合保鲜剂配方进行优化，见表2。待配制的复合保鲜剂完全溶解后，将清洗干净的新鲜鸡蛋放入其中浸泡30 s后捞出，晾干形成完整的涂膜，置于37℃恒温培养箱中加速贮藏，将未涂膜设为对照组，每隔5 d检测鸡蛋的失重率和哈夫单位[17]。

表2 复合保鲜剂配方的正交试验设计表

1.3.4 复合保鲜剂的应用试验

鸡蛋新鲜度的数据处理参照田玥等[18]的方法，以鸡蛋的失重率、哈夫单位值为试验指标。鲜鸡蛋的品质分级参照中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T 10638－2011《鲜鸡蛋、鲜鸭蛋分级》[19]，见表3。一般情况下，市场上鸡蛋的哈夫单位值不低于60，本研究中对哈夫单位值低于40的鸡蛋认定为不可食用，其数据不进行统计。

表3 鲜鸡蛋的品质分级标准

哈夫单位计算公式：

式中，h为蛋白高度，mm；w为全蛋蛋重，g；HU为哈夫单位，Ha。

2 结果与分析

2.1 南五味子中五味子乙素提取工艺优化

2.1.1 南五味子中五味子乙素提取的单因素试验

1）乙醇体积分数对五味子乙素提取率的影响

乙醇体积分数对南五味子中五味子乙素提取率的影响如图1所示。

由图1可知，乙醇体积分数由75%提高到90%时，五味子乙素提取率逐渐增大，乙醇体积分数为90%时，提取率达到最高为1.73 mg/g；而后随着乙醇体积分数的增加提取率逐渐降低。故90%为较佳的乙醇体积分数。

图1 乙醇体积分数对南五味子中五味子乙素提取率的影响

2）料液比对五味子乙素提取率的影响

料液比对南五味子中五味子乙素提取率的影响如图2所示。由图2可知，五味子乙素提取率随着料液比的增加其变化趋势为先增加后减少。料液比为1:8时，五味子乙素提取率最高为1.75 mg/g。可能是由于随着溶剂量的增大，在较短时间内与大量溶剂充分反应，当达到一定程度后大量的溶剂存在影响了整个体系的传质和传热，不利于提取的进行。故1:8为较佳的料液比。

图2 料液比对南五味子中五味子乙素提取率的影响

3）提取温度对五味子乙素提取率的影响

提取温度对南五味子中五味子乙素提取率的影响如图3所示。由图3可知，随着温度增高分子运动速度加快，五味子乙素更易溶出，提取率增大；温度为70℃时，提取率最高为1.69 mg/g；当提取温度持续增高，五味子乙素内部结构被破坏，导致提取率降低，故最佳提取温度确定为70℃。

图3 提取温度对南五味子中五味子乙素提取率的影响

4）提取时间对五味子乙素提取率的影响

提取时间对南五味子中五味子乙素提取率的影响如图4所示。由图4可知，提取时间逐渐增加，五味子乙素提取率也逐渐增加。提取时间为2.5 h时，五味子乙素提取率达到最大值1.74 mg/g；之后时间延续，五味子乙素提取率反而降低，可能是由于细胞内温度升高及在空气中暴露时间延长发生降解或缩合等反应引起的。故2.5 h为较佳的提取时间。

图4 提取时间对南五味子中五味子乙素提取率的影响

2.1.2 南五味子中五味子乙素提取的响应面试验

1）南五味子中五味子乙素提取的响应面试验方案与结果

基于单因素试验结果，以A（乙醇体积分数）、B（料液比）、C（提取时间）为响应面自变量，以五味子乙素提取率为响应值，结果如表4所示。

表4 南五味子中五味子乙素提取的响应面试验方案与结果

对表4中17组试验所得五味子乙素提取率进行响应面分析，可得两两因素相互交汇的三维曲面图，见图5。由图5（a）可见，乙醇体积分数一定时，随着料液比逐渐增加，五味子乙素提取率先升高后降低，料液比为1：7～1：9时，五味子乙素提取率最大；料液比一定时，随着乙醇体积分数的增加，五味子乙素提取率先升高后降低，乙醇体积分数为89%～91%时，五味子乙素提取率最高。结果表明，料液比、乙醇体积分数二者的交互影响对五味子乙素提取率的影响较大。由图5（b）可见，当乙醇体积分数一定时，随着提取时间的增加，南五味子中五味子乙素提取率先升高后降低，提取时间为2.4～2.6 h时，五味子乙素提取率最大，随着时间延长，五味子乙素提取率逐渐降低；提取时间一定时，随乙醇体积分数的增加，五味子乙素提取率先升高后降低，乙醇体积分数为89%～91%时五味子乙素提取率最高。结果表明，乙醇体积、提取时间二者的交互影响对五味子乙素提取率的影响较小。

图5 两两因素对五味子乙素提取率的交互影响

由图5（c）可见，当料液比一定时，随着提取时间的增加，五味子乙素提取率先增加后降低，提取时间为2.4～2.6 h时，五味子乙素提取率最大，随着时间延长，五味子乙素提取率逐渐降低；提取时间一定时，随着料液比的增加，五味子乙素提取率先升高后降低，料液比为1：7～1：9时五味子乙素提取率最大。结果表明，料液比、提取时间二者的交互影响对五味子乙素提取率的影响较为重要。

经响应面优化后，南五味子中五味子乙素最佳提取工艺为：料液比1：8.04、乙醇体积分数90.16%、提取时间2.51 h，模型预测提取率为1.782 mg/g。为了便于操作，将优化后提取工艺修正为：料液比1：8、乙醇体积分数90%、提取时间2.5 h。

利用Design-Expert8.0.6软件对表4中的数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程模型为：R=0.18-2.5×10-4A+2.25×10-3B-1.0×10-3C-2.5×10-4AB+2.25×10-3AC-7.5×10-4BC-5.375×10-3A2-0.012B2-8.875×10-3C2，比较该方程的一次项系数的绝对值，可以看出考察的三个因素对五味子乙素提取率的影响为：料液比>提取时间>乙醇体积分数；方程二次项系数均为负值，推测方程具有极大值点，能够对提取工艺进行优化[20]。

回归模型系数的显著性检验结果见表5，方程的模型极显著（P<0.000 1），模型有意义。方程中 A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC 与 BC 对五味子乙素提取率均具有显著的影响。模型的失拟项不显著，相关系数R2=0.999 6>0.9，R2Adj=0.999 1，表明拟合的回归方程符合实际情况，能较好地反映真实的试验值，此模型可用于对南五味子果实中五味子乙素提取率的分析和预测。

表5 南五味子中五味子乙素提取的回归模型系数的方差分析

2）南五味子中五味子乙素提取的验证试验

响应面试验结果表明：优化工艺条件为料液比1：8、乙醇体积分数90%、提取时间2.5 h。据此最优方案进行五味子乙素提取，提取率为1.77 mg/g，与预期值吻合，可以作为最优方案。

2.2 南五味子中五味子乙素的抑菌性

由表6可知，南五味子中五味子乙素对三种供试菌种均有一定的抑制效果，其中大肠杆菌＜沙门氏菌＜金黄色葡萄球菌。大肠杆菌的MIC为1.00 mg/mL，沙门氏菌的MIC为0.50 mg/mL，金黄色葡萄球菌的MIC为0.125 mg/mL，说明五味子乙素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。

表6 南五味子中五味子乙素的最低抑菌浓度

2.3 复合保鲜剂配方制备及优化

2.3.1 复合保鲜剂配方的单因素试验

1）Vc含量对鸡蛋保鲜效果的影响

根据图6、图7，随着贮藏时间延长，鸡蛋均有一定的失重，其中使用0.27 g Vc的复合保鲜剂的鸡蛋重量减轻较缓，失重率最高为4.8%，比对照低了3.3%；使用0.21 g Vc的复合保鲜剂的鸡蛋哈夫单位变化较小，在同组试验中较高，为67 Ha。

图6 不同Vc含量的复合保鲜剂对鸡蛋失重率的影响

图7 不同Vc含量的复合保鲜剂对鸡蛋哈夫单位的影响

2）柠檬酸含量对鸡蛋保鲜效果的影响

根据图8、图9，其中使用0.48 g柠檬酸的复合保鲜剂的鸡蛋重量减轻较缓，失重率最高为3.1%，比对照低5.6%；使用0.45 g柠檬酸的复合保鲜剂的鸡蛋哈夫单位变化较小，在同组试验中较高，为67 Ha。

图8 不同柠檬酸含量的复合保鲜剂对鸡蛋失重率的影响

图9 不同柠檬酸含量的复合保鲜剂对鸡蛋哈夫单位的影响

3）黄原胶含量对鸡蛋保鲜效果的影响

根据图10、图11，其中使用0.21 g黄原胶的复合保鲜剂的鸡蛋重量减轻较缓，失重率最高为4.8%，比对照低5.1%；使用0.21 g黄原胶的复合保鲜剂的鸡蛋哈夫单位值变化较小，在同组试验中较高，为66 Ha。可能是由于高浓度的黄原胶黏度及稳定性较好，能更好地成膜保护鸡蛋。

图10 不同黄原胶含量的复合保鲜剂对鸡蛋失重率的影响

图11 不同黄原胶含量的复合保鲜剂对鸡蛋哈夫单位的影响

4）五味子乙素溶液对鸡蛋保鲜效果的影响

根据图12、图13，使用11 mL五味子乙素溶液的鸡蛋重量减轻较缓，失重率最高为3.8%，比对照低4.2%；使用9 mL五味子乙素溶液的鸡蛋哈夫单位变化较小，在同组试验中较高，为80 Ha。

图12 不同体积的五味子乙素溶液的复合保鲜剂对鸡蛋失重率的影响

图13 不同体积的五味子乙素溶液的复合保鲜剂对鸡蛋哈夫单位的影响

2.3.2 复合保鲜剂配方的正交试验

根据单因素试验结果，测定试验指标后选出一部分有代表性的水平组合进行正交试验，结果及直观分析见表7和表8。

表7 复合保鲜剂配方的正交试验结果及直观分析

表8 复合保鲜剂配方的正交试验的失重率和哈夫单位的极差分析

由表7和表8可知，正交试验获得的优化复合保鲜剂配方为E3F2G1H3，即在试验贮藏期（25 d）内经11 mL，2 mg/mL五味子乙素溶液+0.21 gVc+0.42 g柠檬酸+0.21 g黄原胶用水定容至100 mL处理过的鸡蛋保藏较好。

2.4 复合保鲜剂的应用效果

将制备的复合保鲜剂应用于鸡蛋在37℃恒温加速贮藏25 d，以未处理组为对照，检测评定感官品质，结果见表9。试验组E3F2G3H3（2 mg/mL五味子乙素溶液11 mL、Vc 0.21 g、柠檬酸0.48 g、黄原胶0.21 g）失重率和蛋白pH显著低于对照，哈夫单位为对照的2.1倍，且蛋壳、蛋黄和蛋白感官质量均保持较好，未出现明显血斑。由此可见，该组合处理在37℃鸡蛋加速贮藏中保鲜效果显著。

表9 37℃加速贮藏后鸡蛋感官评定

3 结论与讨论

基于单因素试验及响应面法优化，得出商洛南五味子中五味子乙素的提取工艺为：提取温度70 ℃条件下，料液比 1:8（g：mL）、90%的乙醇体积分数提取2.5 h，五味子乙素提取率为1.77 mg/g。李树声等[10]采用响应面法优化乙醇浸提五味子乙素，用高效液相色谱仪测定其提取率，与微波辅助、乙醇回流、超临界萃取等方法相比操作简便、省时省力，适于批量提取，可明显节约成本。此研究结果比本研究结果的五味子乙素提取率稍低一点，而本研究结果的五味子乙素提取率比阴冠秀等[21]的研究结果高得多。可能原因：一是由于采摘南五味子乙素果实不适期，错过了南五味子中五味子乙素含量最高的时期，导致部分五味子乙素分解。二是由于粉碎程度不够小，未能将有效成分全部提取。三是提取时水浴锅的温度控制可能会有变化，不能保证恒定，造成误差。

五味子乙素对供试菌种均有一定的抑菌效果，顺序为：大肠杆菌＜沙门氏菌＜金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌的MIC为0.125 mg/mL。制备的复合保鲜剂最优配方为：100 mL水溶液中含2 mg/mL五味子乙素溶液11 mL、0.21 g Vc、0.48 g柠檬酸、0.21g黄原胶，将其应用于新鲜鸡蛋37℃加速贮藏，与空白对照对比，失重率明显降低、哈夫单位变化较小，能延长贮藏期15 d。试验模拟鸡蛋最易受微生物影响腐败变质的温度，日常贮藏条件会优于试验条件，保藏效果会更好。

五味子乙素溶液能有效抑制腐败菌的繁殖，从而延长食品保质期和货架期，故可作为天然保鲜成分，与其它天然安全的材料复配生产新型食品保鲜剂。本研究结果可为商洛南五味子在食品防腐保鲜方面的应用提供参考依据。